花椒萎蔫植株土壤微生物菌落结构特征研究初报

陈 政，李佩洪，龚 霞，唐 伟，吴银明

(四川省植物工程研究院， 四川 资中 641200)

花椒为芸香科花椒属落叶灌木或小乔木，是我国栽培历史悠久的食用调味、香料、油料及药材等多用途经济树种[1]，中国是世界花椒第一生产大国，有39种14变种[2]。四川汉源、茂县，陕西韩城、凤县，重庆江津、甘肃武都，山东莱芜、沂源，河北涉县、平山等地均为我国花椒著名产区[3-7]。四川是全国花椒主产区，截至2017年底，花椒种植面积293 300 hm2，年产量67 900 t，约占全国总产量的17. 9%；产值62. 7亿元，其中干、鲜果收入53亿元，加工产值9. 7亿元[8]。实生花椒树3年开始挂果，5～6 a进入盛果期，一般能维持30～50 a。花椒树具有生长快、结实早、用途广、适应性强、根系发达、能保持水土、栽培管理简便等特点，深受广大群众欢迎。花椒作为重要的经济林木之一，已经广泛种植于山区，已成为当地老百姓的重要经济收入来源之一。但因栽培管理方式原始粗放，椒树树势衰弱，病虫害种类多且危害严重，花椒产量大幅下降。2014-2016年对四川省各花椒主产区的椒园进行走访调查，发现部分主枝和枝条均健康的椒树在挂果期突然萎蔫死亡，田间管理粗放的椒园，萎蔫或死亡现象尤为明显。椒树萎蔫的具体症状为：椒树主枝健康，地上部分叶片变小，并且发黄发白，果实较小，叶片变小变黄，根皮与木质部易脱离，部分木质部呈黑色。为此，我们采集萎蔫植株和健康植株周围土壤，并对其进行检测，比较分析其土壤微生物群落结构和差异，以期找到花椒植株健康生长最佳的土壤微生物群落结构，预防植株萎蔫。

1 研究地概况与研究方法

1.1 研究地概况

试验地为汉源县清溪镇新黎村花椒广场某一椒园。清溪镇位于汉源县城北39 km，为大相岭山脉西南麓的高山河谷地带，地势西北高，东南低，海拔1 600～2 900 m，属于北温带与季风带之间的亚热带季风性湿润气候，冬暖夏热，四季分明。四周环山，谷深岭高，高地寒冷，河谷炎热，雨量偏少且不均，气候垂直变化十分显著。年均降水量600 mm左右，年平均气温11.5 ℃，无霜期300 d，日照时数1 475.8 h。土壤情况：土壤较疏松、黑色壤质土、肥力中等。栽种模式：花椒间作李树。土壤理化特性：含水量为21.68%，pH值为7.44，比重为2.008 g·cm-3，容重为1.190 5 g·cm-3，有机质为22.53 g·kg-1、铵态氮为244.5 mg·kg-1、速效磷为139.7 mg·kg-1，速效钾297.45 mg·kg-1。样品采集时间：2015年8月3日。

1.2 土壤样品采集

利用土壤取样器，随机选取萎蔫或健康椒树，以其为圆心在半径为30 cm的圆周上采集8～10个、深20～30 cm的原状土样并混合为一个土样(1～2 kg)，共采集6个土壤样品(萎蔫或枯死植株3个，编号为HY1、HY2、HY3；健康植株3个，编号为HY4、HY5、HY6)。将6个样品混匀，称取10 g，无菌袋装送至专业检测机构进行宏基因组DNA提取，PCR扩增及llluminaHiseq高通量测序等处理。

1.3 土壤中微生物种类分析

利用llluminaHiseq高通量测序技术对萎蔫或枯死的椒园土壤微生物种类进行分析，主要步骤是通过直接提取土壤微生物的DNA，经纯化处理后，利用引物扩增基因，再进行OTU聚类；为得到每个OTU对应的物种分类信息，采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并在各个水平(genus，species)统计每个样品的群落组成。再与16 s细菌和古菌核糖体数据库、Unite(Release 6.0，http://unite.ut.ee/index.php)真菌数据库、FGR(Functional Genomics Resources)功能基因组资源、RDP(Release11，http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp，GeneBank(Release7.3，http://fungene.cme.msu.edu/)功能基因数据库等进行土壤微生物分类分析。

1.4 不同土壤中微生物群落比较

采用Heatmap比较分析6个土壤样品的微生物在species分类水平上群落组成的相似性和差异性。Heatmap可以用颜色变化来反映二维矩阵或表格中的数据信息，它可以直观地将数据值的大小以定义的颜色深浅表示出来。常根据需要将数据进行物种或样本间丰度相似性聚类，将聚类后数据表示在heatmap图上，可将高丰度和低丰度的物种分块聚集，通过颜色梯度及相似程度来反映多个样本在各分类水平上群落组成的相似性和差异性。软件及算法：R语言vegan包，vegdist和hclust进行距离计算和聚类分析；距离算法：Bray-Curtis，聚类方法：complete。图中颜色梯度可自定为两种或两种以上颜色渐变色。

2 结果与分析

比较分析汉源样地健康植株周围土壤微生物和萎蔫植株周围土壤微生物的群落结构组分，发现细菌类微生物差异(图1)。萎蔫植株周围土壤样品HY1、HY2、HY3中unculturedXanthobacteraceaeblastochiorissp.、unculturedSphiongomonaskaistobactersp.、Anaerolinecoeae、unculturedGemmatimonadaceaegemmatimonadales、uncultured 0319-6A21、Subgroup-2、A0839、GR-WP33-30的丰度明显高于HY4、HY5、HY6健康植株周围土壤；HY1、HY2、HY3中Bacillus、Lactococcuslactissubsp.、unculturedNitrosomonadaceaeburkholderiaceae的丰度明显低于HY4、HY5、HY6健康植株周围土壤。

比较分析汉源样地健康植株周围土壤微生物和萎蔫植株周围土壤微生物的群落结构组分，发现真菌类微生物差异(图2)。萎蔫植株周围土壤HY1、HY2、HY3中Ceratobasidium、Ilyonectria

图1 样品细菌群落结构组成图(heatmap)

图2 样品真菌群落结构组成图(heatmap)

morspanacis、Ilyonectriaanthuriicola、Ilyonectriarobusta、Cryptococcuspodzolicus的丰度明显高于HY4、HY5、HY6健康植株周围土壤中的；萎蔫植株周围土壤中的HY1、HY2、HY3中Penicillium、Cryptocossusterricola、Glomeraceae、Minimedusasp.、Chaetomiumsp.、Mortierellaindohii、Cryptococcuscerealis、Fusariumoaysporumfsp.的丰度明显低于HY4、HY5、HY6健康植株周围土壤。

3 讨论

(1)采用llluminaHiseq高通量测序技术检测出了一种镰刀菌即尖胞镰刀菌，其它种类的镰刀菌只鉴定到属这一水平。尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporium)是一种世界性分布的土传病原真菌，主要危害葫芦科(Cucurbitaceae)植物、香蕉(Musanana)、番茄[9](Lycopersiconesculentum)、茄子(Solanummelongena)、辣椒(Capsicumannuum)和棉花(Gossypiumspp.)等高经济价值作物。尖孢镰刀菌的防控十分困难，主要是因为它除了在宿主植物中存活外，在土壤及空气中存活10 a以上仍表现出很强的致病性[10]。健康植株附近的(HY4、HY5、HY6)土样中尖孢镰刀菌的丰度大于萎蔫植株附近土样。可见，尖孢镰刀菌不是引起花椒植株萎蔫的病原菌。

(2)采用llluminaHiseq高通量测序技术分类分析感病植株和健康植株周围土壤的微生物菌落结构特征和差异，土壤微生物群落组分及微生物菌种间相互作用，及土壤微生物对花椒植株萎蔫的影响。从分析结果可以看出，萎蔫植株周围土壤中芽孢杆菌(Bacillus)明显低于健康植株周围土壤，可从健康植株周围土壤分离纯化芽孢杆菌菌株，筛选部分优势芽孢杆菌菌株，再将优势芽孢杆菌制成菌液或菌肥浇灌于萎蔫植株周围土壤，根据萎蔫植株的后续长势初步判断施用专用型芽孢杆菌菌肥能否预防植株萎蔫。李姝江[11]等人对花椒根腐病生防芽孢杆菌进行分离、筛 选、定殖和防效评价,在分 离 获 得 的20株 芽 孢 杆 菌 中，编号为B3的菌株拮抗作用最强，突变菌株B3无论预防还是治疗试验，均能发挥很好的效果，并优于原始菌株和化学农药双效灵。

(3)花椒为浅根系植物，其根系主要分布在20～50 cm土壤中，故本试验中采集20～30 cm土壤样品中已包含其根际土壤，即土壤样品中的微生物不仅含有根际土壤微生物，还含有根部周围的土壤微生物。土壤样品为混合样品，故未对根际土壤微生物群落结构进行单独分类和分析。

(4)除土壤因素引起花椒植株萎蔫外，还有病虫害也会引起植株萎蔫，如花椒黄叶病，其表现症状为个别叶脉绿色、叶片变黄、叶缘发白，严重时叶缘焦枯，黄叶病是缺锌、缺铁的表现，可通过施用专用型生物菌肥补充锌、铁等元素，使叶片恢复正常。此外，还有虫害也可引起花椒植株萎蔫，天牛科2～3龄幼虫钻食树干，咬食树皮，树干被钻食成许多洞孔，伤处流出牛皮胶液，可引起树干干枯死亡[12]。检查树干上有无洞孔或牛皮胶液，可初判是否由蛀干害虫引起植株萎蔫。连续干旱亦可引起花椒植株萎蔫，干旱胁迫引起成片植株出现萎蔫，发现嫩梢开始萎蔫时，可通过灌水来验证，若灌水后植株恢复正常生长则是干旱引起的萎蔫，反之则不是。