脂肪酶对革胡子鲶鱼糜凝胶品质的影响

苏瑞华,焦熙栋,范大明,,3,*,黄建联,赵建新,3,闫博文,周文果,张文海,叶伟建,张 灏,3

(1.食品科学与技术国家重点实验室,国家功能食品工程技术研究中心,食品学院,江南大学,江苏无锡 214122;2.农业农村部冷冻调理水产品加工重点实验室,福建厦门 361022;3.江苏省食品安全与质量协同创新中心,江苏无锡 214122)

鱼糜制品因其蛋白含量高,易消化吸收,且运输储存方便,深受消费者喜欢。鲶鱼脂肪含量大于5%,属于高脂鱼类[1],其鱼油不饱和程度高[2],有降低发炎反应、预防心血管疾病等的功效[3]。因此,利用鲶鱼制备鱼糜制品,可以为产品提供丰富的营养价值,以此生产高附加值产品。但是由革胡子鲶鱼制备得到的鱼糜制品品质一般不如一些低脂鱼[4],主要是因为革胡子鲶鱼肉中大量的脂肪干预了凝胶的形成,破坏了蛋白质的凝胶网络,降低了产品品质[5]。

脂肪酶作为一种生物催化剂,天然作用底物为三酰基甘油酯,水解后释放出甘油类物质和游离脂肪酸[6]。脂肪酶本身是活细胞产生的活性蛋白,不产生有毒物质,且酶具有高度专一性、催化效率高的特性,在作用的同时不对其它成分造成影响[7],因此脂肪酶适用于富含蛋白质产品的生产中,以提高肉制品的品质。鱼糜生产过程中,漂洗和斩拌都会影响到脂肪在蛋白凝胶中的存在,漂洗可以去除鱼肉中的部分脂肪和可溶性成分,达到富集肌原纤维蛋白的目的[8]。斩拌过程对脂肪进行剪切,使得脂肪能够被蛋白包裹,增加蛋白凝胶制品的稳定性[9]。在漂洗和斩拌过程中对脂肪进行调控,通过改变脂肪在蛋白凝胶中的含量和存在状态以改善革胡子鲶鱼糜的凝胶品质。

近年来已有一些研究针对高脂鱼鱼糜凝胶品质进行改善,杨华等[10]研究了Tg酶、结冷胶和大豆分离蛋白的加入对鲶鱼鱼糜凝胶性能的改善作用,Priyadarshini等[11]通过改变漂洗方式对传统水洗方式进行改善,得到较优的鱼糜生产方法,Amiza等[12]则通过在鱼糜中添加海藻粉来提高鲶鱼鱼糜凝胶强度。以上研究都能够起到改善高脂鱼糜凝胶品质的目的,但多数只是添加胶凝剂而忽略了鱼肉中脂肪对蛋白凝胶的影响作用。本研究以高脂鱼的一种—鲶鱼作为研究对象,分别在漂洗和斩拌过程中加入脂肪酶,通过控制脂肪酶对脂肪的水解作用,以影响革胡子鲶鱼肉中脂肪对蛋白凝胶的干预作用,改善其凝胶品质,制备得到凝胶强度更高,外观颜色更佳的产品。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

革胡子鲶 江苏无锡欧尚超市;Lipozyme TL 100 L脂肪酶 诺维信(中国)生物技术有限公司;食盐 江苏盐业集团有限公司;聚乙烯肠衣 漳州市龙海日升塑料彩印包装有限公司;橄榄油、聚乙烯醇、氢氧化钠、5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)、亚硫酸钠、戊二醛、锇酸、乙醇 国药集团化学试剂有限公司。

斩拌机 福建安井食品股份有限公司;MO-385型莫菲绞肉机 佛山桃花岛电器有限公司;T80-980脱水机 中国扬子电器;SZ200型手摇式灌肠机 南京威利朗食品机械有限公司;SU504型手动式U型封口机 河北衡水鸿昊企业有限责任公司;MP-15型双槽恒温水浴锅 南京先欧仪器制造公司;FA25型高速匀浆机 德国弗鲁克公司;TA-XTplus物性分析仪 英国SMS公司;Ultra Scan Proll66高精度分光测色仪 美国Hunterlab公司。

1.2 实验方法

1.2.1 脂肪酶酶活最适条件测定 按照GB/T 23535-2009 《脂肪酶制剂》测定脂肪酶酶活力,通过改变缓冲液pH和水浴温度来测定脂肪酶作用最适条件。每个条件下脂肪酶酶活的测定均取两个100 mL烧杯,于空白杯A和样品杯B中各加入底物溶液(将橄榄油与3倍体积4%聚乙烯醇(PVA)高速匀浆处理6 min得到乳白色PVA乳化液)4 mL和磷酸缓冲液(pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)5 mL,再于A杯中加入95%乙醇15 mL,于测定温度(0、10、20、30、40、50、60 ℃)下水浴放置,然后于A、B杯中各加待测酶液1 mL,立即混匀计时,准确反映15 min后,于B杯中立即补加95%乙醇15 mL终止反应,取出。在烧杯中加入一枚转子,置于电磁搅拌器上,边搅拌边用氢氧化钠标准溶液滴定,直至pH至10.3,为滴定终点,记录消耗氢氧化钠溶液的体积。根据以下公式计算脂肪酶活力:

式中:X1为样品的酶活力,U/g;V1为滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液的体积,mL;V2为滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液的体积,mL;c为氢氧化钠标准溶液浓度,mol/L;50表示每毫升0.05 mol/L氢氧化钠溶液相当于脂肪酸50 μmol;n1为样品的稀释倍数;0.05为氢氧化钠标准溶液浓度换算系数;1/15-反应时间15 min。

1.2.2 原料的预处理及鱼糜凝胶的制备 原料预处理参考李鹏[13]的方法,将新鲜鲶鱼加冰运回实验室,宰杀后去头去内脏。取其背部肌肉去皮后,切成条状,用清水(<10 ℃)冲洗干净表面血渍,沥去表面水备用。将切块后的鱼肉放入绞肉机中,绞碎得到鲶鱼碎肉。取适量鲶鱼碎肉进行漂洗,漂洗结束后,将鲶鱼碎肉以双层纱布包裹,置于脱水机中进行脱水,控制最终水分含量一致,得到新鲜鱼糜(经测定,鱼糜水分含量为84%)。

鱼糜凝胶制备参考Zhang等[14]的方法,称取适量上述新鲜鱼糜,置于斩拌锅中。低速(3000 r/min)空斩2 min,均匀加入3%的食盐,盐斩3 min至鱼糜浆料完全分散成浆。均匀加入脂肪酶,混合斩拌2 min使得浆料进一步混合,促进鱼肉原料与脂肪酶充分接触进行反应。斩拌机置于冰水中,防止斩拌过热。将斩拌好的鱼浆用灌肠机挤压至聚乙烯肠衣(直径2.5 cm)中,将肠衣两端密封后进行二段式加热(40 ℃水浴加热30 min,90 ℃水浴加热20 min)。加热结束后立即置于冰水中冷却至室温得到鱼糜凝胶,放置于4 ℃冰箱过夜(12 h)后测定其凝胶性质。

1.2.3 脂肪酶添加条件优化 脂肪酶的添加方式分为在漂洗液中添加、在斩拌过程中添加,控制在漂洗时脂肪酶的添加量、处理时间和鱼水质量比,以及在斩拌式脂肪酶的添加量,考察这些因素对鱼糜凝胶特性的影响。

1.2.3.1 漂洗过程的添加 漂洗过程为蒸馏水漂洗两次后,在蒸馏水中加入脂肪酶进行第三次漂洗。前两次蒸馏水漂洗时间均为10 min(搅拌6 min,静置4 min),漂洗加水量为鱼肉质量的五倍,漂洗全程温度为0 ℃。

a. 脂肪酶添加量的确定:脂肪酶添加量分别为0%、0.2%、0.4%、0.5%、0.6%、0.8%、1.0%,处理时间为10 min,鱼水质量比为1∶5;

b. 处理时间的确定:脂肪酶添加量取a中最优值,处理时间分别为0、6、8、10、15、20、25 min,鱼水质量比为1∶5;

c. 鱼水质量比的确定:脂肪酶添加量取条件a中最优值,酶处理时间取条件b中最优值,鱼水质量比分别为1∶3、1∶4、1∶5、1∶6。

1.2.3.2 斩拌过程的添加 漂洗过程为蒸馏水漂洗三次,每次漂洗时间为10 min(搅拌6 min,静置4 min),漂洗加水量为鱼肉质量的五倍,漂洗全程温度为0 ℃。斩拌添加量按鱼肉质量的0%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、2.5%加入。

1.2.4 鱼糜凝胶脂肪含量测定 按照GB 5009.6-2016 《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》进行。

1.2.5 鱼糜凝胶强度的测定 参考Balange等[15]的方法并略做修改,将鲶鱼鱼肠切成高为25 mm的圆柱体,用TA-XTplus质构仪测定其凝胶强度。测试探头为球形探头P/5S,触发力为10 g,下压距离为15 mm,初探速度2 mm/s,探测速度1 mm/s,测后速度10 mm/s。凝胶强度用破断力(g)和破断距离(cm)的乘积表示,每组至少测定6个平行样品,结果取平均值。按照以下公式计算凝胶强度:凝胶强度(g·cm)=破断力(g)×破断距离(cm)。

1.2.6 鱼糜凝胶白度值的测定 参考Park等[16]的方法,将鱼肠切成厚度10 mm的薄片,校正后然后采用仪器测量并记录L*、a*、b*,根据以下公式计算出白度:

W=100-[(100-L*)2+a*2+b*2]1/2

式中:W代表白度,数值越大代表颜色越白,反之越黑;L*代表明度;a*代表红度,正值表示偏红,负值表示偏绿;b*代表黄度,正值表示偏黄,负值表示偏蓝;每个样品重复测定3次,然后求取平均值。

1.2.7 鱼糜凝胶持水力的测定 参考Benjakul等[17]的方法并略做修改。将待测鱼肠切成厚为2 mm左右的薄片,精确称取5 g样品质量记为M1,以4层滤纸包裹放入50 mL离心管中,4 ℃下5000 r/min离心20 min,称取离心后的鱼肠样品质量M2。每个样品重复5次,按照以下公式计算持水力:

WHC(%)=M2/M1×100

1.2.8 鱼糜凝胶中二硫键含量测定 参考Benjakul等[18]的方法进行测定。分别选用上述1.2.3中脂肪酶漂洗组和斩拌添加脂肪酶组中凝胶强度最大时的条件,与未添加脂肪酶的空白组进行比较。具体方法为:用NTSB(将100 mg 5,5-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)溶于10 mL 1 mol/L Na2SO3中,通入氧气至溶液颜色为淡黄色制得)试剂法测定,并略作修改。向1 mL肌原纤维蛋白(5 mg/mL)中加入3 mL NTSB(pH9.5),置于黑暗处反应25 min,然后测定412 nm处的吸光值。

式中:A代表吸光度;B代表蛋白含量;C代表摩尔消光系数(13900 mol-1·cm-1);D代表稀释倍数。

1.2.9 微观结构的测定 参考Kubota等[19]的实验方法,将鱼肠样品中心部分切成2～3 mm厚的小块,经5%戊二醛(0.1 mol/L磷酸缓冲液,pH7.2)前固定,0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗;再经1%锇酸(0.1 mol/L磷酸缓冲液,pH7.2)后固定,0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗;然后依次用50%、70%、80%和90%(V/V)的乙醇进行梯度脱水,各梯度脱水时间均为15 min,最后再经无水乙醇脱水30 min。冷冻干燥后将样品固定在样品台上,离子溅射仪镀膜后置于扫描电子显微镜下观察。

1.3 数据分析

每个样品设3个平行,采用OriginPro 2017进行数据分析,测定结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 处理条件对脂肪酶酶活的影响

2.1.1 pH对脂肪酶酶活的影响 不同pH对脂肪酶酶活的影响如图1所示。极小或者极大的pH会对鱼糜蛋白产生酸溶或者碱溶,破坏鱼糜蛋白质,不适于鱼糜加工生产,因此对pH为6～8的范围内研究其对脂肪酶酶活的影响。实验结果表明,随着pH的增加,脂肪酶酶活呈现先升高后降低的趋势,7.5左右为最适pH。pH的改变会影响酶分子活性部位上有关基团的解离,当其处于最适pH时,酶分子上的活性基团的解离状态最适于与底物结合。而pH高于或低于最适pH时,活性基团的解离状态发生改变,酶和底物的结合力降低,因此酶活减小。本实验中用到的去离子水pH为7.5,因此实验过程中不对pH进行调整。

图1 不同pH下脂肪酶酶活变化

2.1.2 温度对脂肪酶酶活的影响 鱼糜加工过程中温度会影响鱼肉新鲜度,而鱼肉新鲜度的下降会导致鱼糜凝胶品质变差,因此在漂洗过程中应控制温度始终低于10 ℃。斩拌成型后立即进行40 ℃水浴加热,若在斩拌过程中加入脂肪酶,则酶催化反应主要发生在该阶段。过高的温度会导致酶失活,因此对0～60 ℃范围内温度对酶活的影响进行研究。不同温度对脂肪酶酶活的影响如图2所示。实验结果表明,随着温度的升高,脂肪酶酶活先增加后降低,40 ℃左右为最适温度。温度范围在0～10 ℃内变化幅度较小,因此在漂洗过程中应尽量降低漂洗液的温度,保证鱼肉新鲜度。

图2 不同温度下脂肪酶酶活变化

2.2 脂肪酶漂洗对鱼糜凝胶品质的影响

2.2.1 脂肪酶漂洗对鱼糜凝胶脂肪含量的影响 脂肪酶对鱼糜凝胶脂肪含量的影响如图3所示。由图3中可以看出,添加脂肪酶后鱼糜凝胶脂肪含量均低于未添加脂肪酶的空白组。由图3a可以看出,脂肪酶添加量对鱼糜凝胶脂肪含量影响较小,不同脂肪酶添加量下鱼糜凝胶脂肪含量均介于7.5%～8%之间。如图3b所示,酶处理时间对脂肪含量影响较大,随着酶解时间的增长,脂肪含量有所下降,达到最低值后,继续增加酶解时间,脂肪含量有所增加。这可能是由于脂肪水解反应为可逆反应,过度延长酶解时间会造成水解反应逆向进行,水解程度降低,脂肪酶效果下降。图3c为鱼水质量比对脂肪含量的影响,一般而言,水量越多,鱼肉中脂肪漂洗效果越好,脂肪残留量越低。但加入脂肪酶漂洗脂肪含量对鱼糜凝胶品质有较大的影响,有研究表明在罗非鱼鱼糜凝胶中添加油脂会导致鱼糜凝胶强度降低,鱼糜品质变差[20],但也有研究表明,随脂肪含量的增加,鱼糜凝胶强度显著增加[21],鱼糜中脂肪种类与含量对鱼糜凝胶品质的影响也有所差别。

图3 脂肪酶漂洗前后鱼糜凝胶脂肪含量变化

2.2.2 脂肪酶漂洗对鱼糜凝胶强度的影响 凝胶强度是评价鱼糜制品质构特征和品质的重要指标,脂肪酶对鱼糜凝胶强度的影响如图4所示。从图4中可以看出,未添加脂肪酶的空白组鱼糜凝胶强度(64.5 g·cm)均低于添加脂肪酶漂洗组,这可能与漂洗液中加入脂肪酶后,促进脂肪水解,从而改变体系整体脂肪含量相关。如图4a、4b所示,随着脂肪酶添加量的增加和酶处理时间的增长,凝胶强度均呈现先增大后减小的趋势,当添加量为0.4%,脂肪酶处理时间为10 min时,鱼糜凝胶强度值最高。脂肪酶添加量和酶解时间直接影响到脂肪的水解程度,进而影响脂肪对蛋白凝胶的作用关系。当鱼糜中含有大量的脂肪时,蛋白质不能完全包裹住脂肪,因而油脂不能完全乳化,从而破坏蛋白凝胶网络的形成[22],甚至造成“漏油”的现象。这与米红波等[23]的研究结果类似,其实验结果表明,向鱼糜中添加油脂会降低鱼糜的凝胶强度。但适量的脂肪能够对蛋白凝胶起到一定的物理填充作用,导致其网络结构更加致密[24],凝胶强度更高。另外漂洗过程中的鱼水质量比也会影响鱼糜凝胶品质,如图4c所示,随着鱼水质量比的增加,凝胶强度也呈现先增大后减小的趋势,鱼水质量比的大小一方面会影响到脂肪酶在漂洗液中的浓度,增大鱼水质量比会导致脂肪酶和鱼肉脂肪接触程度减小;另一方面,在漂洗过程中大量的水可以增加漂洗效果,洗去更多脂肪。综合两种因素,当鱼水质量比为1∶5时,鱼糜凝胶强度最大。

图4 脂肪酶漂洗前后鱼糜凝胶强度变化

2.2.3 脂肪酶漂洗对鱼糜凝胶白度的影响 鱼糜凝胶白度值用于反映鱼糜制品的色泽及品质等级,是衡量鱼糜制品品质的一个重要指标。图5为通过在漂洗液中加入脂肪酶进行漂洗后,鱼糜凝胶白度的变化,由图5a及图5b可以看出,脂肪酶漂洗可以有效提高鱼糜凝胶白度值,脂肪酶漂洗组鱼糜凝胶白度值均大于未使用脂肪酶的空白组,且随着脂肪酶添加量的增加,白度值增加。而由图5c可以发现,鱼水质量比对鱼糜凝胶白度影响较小。未添加脂肪酶组内脂肪含量较高,而脂肪中可能含有一些脂溶性色素,这种色素不能通过蒸馏水漂洗除去。另外,脂肪酶解漂洗后凝胶结构更加致密的,提高了鱼糜制品的表皮反射率,使其亮度得以提高,也起到一定的增白作用[25]。

图5 脂肪酶漂洗前后鱼糜凝胶白度变化

2.2.4 脂肪酶漂洗对鱼糜凝胶持水力的影响 持水力可以在一定程度上用于表示凝胶结构的保水能力,与产品的质地、口感等有很大的关系[26]。由图6可以看出,相比空白组,添加脂肪酶漂洗后对鱼糜凝胶持水力有一定提升效果,但提升程度较小。这可能是由于致密的蛋白网络结构能够增加凝胶网络锁水能力[27],因此图6中随着脂肪酶添加量的增加(图6a)、酶处理时间的增长(图6b)和鱼水质量比的增加(图6c),持水力在初期呈现上升的趋势。但是脂肪对蛋白网络的填充作用可能也会增加网络结构的疏水性,使得凝胶网络中的水减少,因此过度增加脂肪酶的量(图6a)、增长处理时间(图6b)和鱼水质量比(图6c),鱼糜凝胶持水力又开始下降。综合两个因素,脂肪酶漂洗对持水力的影响较小。

图6 脂肪酶漂洗前后鱼糜凝胶持水力

2.3 斩拌过程添加脂肪酶对鱼糜凝胶品质的影响

添加脂肪酶作用于鱼糜脂肪的方式,除以上所述在漂洗过程中添加外,也可以直接在斩拌过程中加入。图7为斩拌过程中加入脂肪酶对鱼糜凝胶的影响,如图7a所示,添加脂肪酶后,脂肪含量均低于未添加脂肪酶的空白组,最多降低了原来的34.5%，但添加脂肪酶各组间脂肪含量差别不大。斩拌添加脂肪酶组(图7a)脂肪含量水平低于漂洗添加组(图3),漂洗添加脂肪酶是将脂肪酶混入水中进行漂洗,对脂肪酶有一定的稀释作用,而斩拌添加是直接将脂肪酶加入到鱼糜碎肉中,这样脂肪酶与脂肪接触并进行反应的程度更高。从图7b可以看出,添加脂肪酶后,鱼糜凝胶强度得到大幅度提升,且当添加量为0.75%时,鱼糜凝胶强度达到最大值，提升至原来的2.3倍。且斩拌加酶组(图7b)中凝胶强度最大值(127.6 g·cm)大于漂洗加酶组(图4)的最大值(111.3 g·cm),这可能是由于漂洗过程中加入脂肪酶后,未及时进行灭酶处理,在加热熟化前脂肪酶一直发挥作用,造成酶解时间过长,水解反应逆向进行。而在斩拌过程中加入脂肪酶,斩拌过后及时进行加热熟化,严格控制酶解时间,酶解程度适中,所以凝胶强度值更高。另外,由图7c所示,随脂肪酶添加量的增加,鱼糜凝胶白度值显著高于未添加脂肪酶的空白组(80.6),最多增大了原来的4.9%,且最大值(84.6)略大于漂洗添加组(图5)中的最大值(83.1),这与脂肪酶不同添加方式对脂肪含量影响的结果一致,斩拌过程中脂肪含量减少程度更高,得到的鱼糜凝胶颜色也更白。由图7d可以发现,在斩拌过程中添加脂肪酶后,鱼糜凝胶持水力略有下降,但下降程度较小,这种改变对鱼糜制品口感不会产生太大影响。

图7 斩拌中添加脂肪酶前后鱼糜凝胶品质变化

2.4 脂肪酶对鱼糜凝胶中二硫键含量的影响

分别选取漂洗和斩拌加酶组中凝胶强度值最高的样品(漂洗添加组:脂肪酶添加量为0.4%,处理时间为10 min,鱼水质量比为1∶5;斩拌添加组:脂肪酶添加量为0.75%)作为代表,与未添加脂肪酶的空白组样品进行分析比较。二硫键是稳定蛋白质凝胶结构的重要化学键,二硫键的生成可以使蛋白质网络结构更加致密[28],增加其凝胶强度。如图8所示,在漂洗和斩拌过程中添加脂肪酶,均会导致鱼糜凝胶中二硫键含量增加(漂洗组为38 mol/105g,斩拌组为4.3 mol/105g),这可能是由于加入脂肪酶后,脂肪水解程度增大,水解后的脂肪更易于氧化,而脂肪氧化产生的自由基会引起蛋白氧化,促进巯基更多的转化为二硫键[29],进而稳固了蛋白凝胶结构。

图8 脂肪酶不同添加方式下二硫键含量变化

2.5 脂肪酶对鱼糜凝胶结构的影响

一般而言,鱼糜蛋白凝胶结构比较平整有序,其凝胶强度会越高[30]。如图9所示为添加脂肪酶前后鱼糜凝胶结构对比。由图9a可以看出,未添加脂肪酶的空白组中,脂肪球较完整,表面被蛋白所包裹缠绕,散乱的分布在鱼糜凝胶网络中,且其凝胶结构较粗糙,网孔分布不均匀,空洞较多。加入脂肪酶后(图9b、9c),脂肪球表面开始出现褶皱变形,表面有空洞,凝胶结构也变得平整。图9b为斩拌添加脂肪酶结果,该条件下几乎未见较大的完整脂肪球,表明脂肪水解较为充分,凝胶网络排列非常有序,结构也很致密。图9c为漂洗添加脂肪酶后的结果,漂洗加酶方式也会促进脂肪水解,但该条件下得到的鱼糜凝胶结构平整度和致密度均低于斩拌添加方式,这与上述凝胶强度结果一致,斩拌和漂洗过程中添加脂肪酶均能改善革胡子鲶鱼糜凝胶强度,且斩拌添加方式优于漂洗添加。

3 结论

革胡子鲶鱼肉中过量的脂肪阻碍了鱼肉蛋白凝胶过程,通过在鱼糜加工过程中添加脂肪酶可以有效地改善鱼糜凝胶制品品质,在漂洗和斩拌过程中添加均能达到较好的凝胶品质改善效果,制得的鱼糜凝胶强度和白度值均有效提高,凝胶强度由原来的64.5 g·cm分别增加到111.3 g·cm和127.6 g·cm,白度值由原来的80.6分别增加到83.1和84.6。另外,斩拌添加脂肪酶后二硫键含量(4.3 mol/105g)高于漂洗添加得到的二硫键含量(3.8 mol/105g),且凝胶网络结构更加致密、平整,因而凝胶强度更高。综上,添加脂肪酶可用于改善革胡子鲶鱼鱼糜凝胶品质,为革胡子鲶鱼作为鱼糜原料进行工业生产提供理论依据。