益生菌山药饮料发酵工艺优化及其冷藏稳定性

黄 天,韩之皓,郭 帅,郑 岩,王月娇,白 梅,王记成,孙天松

(内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室农业部奶制品加工重点实验室,内蒙古呼和浩特 010018)

山药又称薯蓣,为薯蓣蔓性植物的块茎[1],其性甘、平、无毒,常食之可强健身体,有助于消化[2]。 山药中含淀粉、人体必需的蛋白质、氨基酸、维生素、微量元素和皂甙黏液质等营养成分[3]。

作为传统的药食同源食品,对山药的加工利用一直是人们研究的重点[4]。山药经糖化酶糖化后接种益生菌发酵可加工成具有益生作用的发酵食品。益生菌发酵作用既提高了制品的营养价值为制品增加了益生特性,又改善了产品的风味、口感[5]。研究开发益生菌发酵山药饮料,不仅增加了国内乳酸菌饮品种类,也为山药综合开发利用提供了新的途径。

近年来山药发酵饮料在国内的研究开发上,大部分都集中在复合型山药发酵饮料、山药发酵乳以及山药发酵醋的应用上[6-8]。卢霖等[9]以薏米、山药为主要原料,通过对发酵工艺条件进行研究,制备出口感柔和细腻、滑润爽口、米香豆香纯正的薏米山药乳酸饮料;高晗等[10]对山药发酵乳工艺配方进行优化,制备出口感细腻、组织均匀且凝固性好,富有浓郁的山药香气的山药发酵乳。国外对山药的研究主要集中在有效成分上,发酵饮料相关文献鲜有[11]。

本研究以山药粉为原料,以益生菌L.plantarumP-8和B.lactisV9为发酵剂发酵山药饮料,将益生菌与山药结合,开发一种兼具山药的营养价值及益生菌益生功能的益生菌山药饮料。目前国内市场还未有以山药为原料制成的发酵型活菌饮料,因此具有广阔的市场前景。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

本研究所用L.plantarumP-8和B.lactisV9直投式发酵剂 均由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室乳酸菌菌种库提供;山药粉 购自河南省焦作县;耐高温a-淀粉酶(酶活18万U/g)、糖化酶(酶活26U/g) 购自沧州夏盛酶生物技术有限公司。

HWS28型电热恒温水浴锅 上海一恒科技有限公司;vortex-genie2涡旋振荡器 美国Scientific Industries公司;HA-300M全自动高压蒸汽灭菌器 日本HIRAYAMA公司;pHS-3C 型pH计 上海雷磁仪器厂;LRH-250生化培养箱 上海一恒科技有限公司;SRH高压均质机 上海申鹿均质机有限公司;SJ-CJ-2FDQ超净工作台 苏州苏洁净化设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 益生菌山药饮料制作流程 将山药粉和水按1∶7料水比混合均匀,在25 MPa下均质后升温至90 ℃添加耐高温a-淀粉酶(酶添加量0.2%,酶解pH6.5)进行液化工艺,酶解60 min后冷却至60 ℃添加糖化酶(酶添加量0.2%,酶解pH4.4)进行糖化工艺,以碘比色法判断山药淀粉水解是否完全[12]。酶解完全后升温至95 ℃,进行95 ℃ 300 s灭酶后冷却至37 ℃(得到酶解山药浆)进行接菌(接种量2×106CFU/mL),恒温发酵18 h后终止发酵并进行调配,在25 MPa下均质后进行罐装,最终得到益生菌山药饮料成品。

1.2.2 益生菌山药饮料发酵条件单因素实验

1.2.2.1 发酵时间的确定 将益生菌L.plantarumP-8和B.lactisV9按1∶1复配,以2×106CFU/mL接种量接种至酶解山药浆中,37 ℃分别发酵0、3、6、9、12、15、18、21、24 h,以活菌数、滴定酸度和pH为评价指标,确定合适的发酵时间。

1.2.2.2 接种量的确定 将益生菌L.plantarumP-8和B.lactisV9按1∶1复配,分别按1×106、2×106、3×106、4×106、5×106CFU/mL的接种量接种至酶解山药浆中37 ℃发酵至1.2.2.1确定的发酵时间,以活菌数、滴定酸度和pH为评价指标,确定合适的接种量。

1.2.2.3 发酵温度的确定 将益生菌L.plantarumP-8和B.lactisV9按1∶1复配,以1.2.2.2节确定的接种量接种至酶解山药浆中,分别在33、35、37、39、41 ℃下发酵至1.2.2.1确定的发酵时间,以活菌数、滴定酸度和pH为评价指标,确定合适的发酵温度。

1.2.3 益生菌山药饮料发酵条件响应曲面法优化试验 根据响应面软件Design-Expert 8.0.6 Trial中Response surface选项卡下Box-Behnken的中心组合试验设计原理,在单因素实验的基础上,采用3因素3水平的响应曲面分析方法。pH是指溶液中氢离子的总数和总物质的量的比,滴定酸度是指溶液中能与强碱发生中和作用的物质的总量。因此滴定酸度比pH更能代表发酵过程中酸度的变化,故确定酶解山药浆活菌数和滴定酸度为响应值,以接种量、发酵时间、发酵温度为自变量,分别以A、B、C表示,并以1、0、-1分别代表自变量的高、中、低水平。试验因素水平及编码见表2。

表2 响应面优化试验因素与水平Table 2 Factors and levels of response surface expcriment

1.3 益生菌山药饮料贮藏试验

将发酵后酶解山药浆进行调配、均质后得到益生菌山药饮料成品,对其进行贮藏试验。样品于4 ℃下贮藏28 d,每隔7 d取样,测定样品的pH、滴定酸度和活菌数,并对样品进行感官评定。

1.4 指标测定

1.4.1 pH的测定 采用雷磁 pH S-3C型pH计测定。

1.4.2 滴定酸度的测定 益生菌山药饮料的滴定酸度按照国家标准GB 5009-239-2016中规定的“酚酞指示剂法”进行检测[13]。

1.4.3 活菌数的测定 将益生菌山药饮料取样进行梯度稀释,采用MRS培养基倾注培养测定活菌数[14]。

1.5 发酵山药饮料样品感官评定

贮藏期间,每隔14 d对益生菌山药饮料贮藏样品进行一次感官评定。感官评定小组由10名评定人员组成,10名评定人员经常饮用活性乳酸菌饮料且全部为食品专业学生,并接受两次两小时的评鉴培训[15]。评分采用100分制[16],具体感官评定标准见表3。

表3 饮料感官评定方案Table 3 Evaluate method of sensory of beverage

1.6 数据处理

每组实验重复3 次,数据均以平均值表示。实验图表采用Origin Pro绘制,响应面试验设计与分析采用Design-Expert 8.0软件。

2 结果与分析

2.1 益生菌山药饮料发酵条件单因素实验

2.1.1 发酵时间的确定 酶解山药浆在发酵过程中活菌数、滴定酸度和pH随时间变化测定结果如图1所示。

图1 发酵时间对酶解山药浆活菌数、滴定酸度和pH的影响

由图1可知,在接种量和发酵温度一定的情况下,酶解山药浆活菌数随发酵时间延长呈不断上升趋势。当发酵时间达18 h后,随发酵时间的延长活菌数变化不显著,说明18 h后益生菌生长已经处于稳定状态。

随发酵时间的延长,酶解山药浆pH不断下降,滴定酸度不断上升。这是由于在发酵过程中,益生菌不断利用发酵基质中的糖类产酸,使乳酸累积,酸度上升[17]。当发酵时间达18 h后,随发酵时间延长滴定酸度略有增加,基本呈平缓趋势;pH随发酵时间的延长无显著变化,此时pH达到3.85左右,与唐维媛等[18]的研究结果有相似之处。

益生菌发酵产酸量及发酵的完全程度会受到发酵时间的直接影响。发酵时间过长,产酸量大,酸度过低;发酵时间过短,发酵进行不完全[19]。复合益生菌发酵不仅可提高活菌数,还可对产品的酸度和风味等产生积极影响。综合发酵时间对活菌数、滴定酸度及pH的影响结果,确定适宜的发酵时间约为18 h。

2.1.2 接种量的确定 酶解山药浆在不同接种量下37 ℃恒温发酵18 h后活菌数和酸度测定结果如图2所示。

图2 接种量对酶解山药浆活菌数、滴定酸度和pH的影响

由图2可知,在发酵温度和发酵时间相同的情况下,不同接种量的酶解山药浆在发酵终止时活菌数随接种量增大呈逐渐上升的变化趋势。当接种量高于2×106CFU/mL后,随接种量增大活菌数上升趋势无显著变化。说明当接种量为2×106CFU/mL时,此时底物浓度与益生菌的比例接近最佳,增加接种量对活菌数增长没有明显变化。

发酵终止时酶解山药浆pH随接种量增大呈逐渐下降的变化趋势。当接种量高于2×106CFU/mL后,pH下降趋势不显著。

发酵终止时酶解山药浆滴定酸度随接种量增大呈逐渐上升的变化趋势。当接种量高于2×106CFU/mL后,滴定酸度上升趋势随接种量增大变化不显著,与发酵终止时活菌数的增长趋势相符合。

发酵剂接种量不仅对酶解山药浆活菌数和酸度产生直接影响,对发酵结束后饮料的口感及风味也起到决定性作用。接种量过小,产酸速率慢,发酵时间延长;接种量过大,产酸速率快,发酵前期酸度上升过快导致发酵后饮料风味变差[20]。综合接种量对活菌数、滴定酸度及pH的影响结果,确定L.plantarumP-8和B.lactisV9按1∶1复配发酵酶解山药浆的适宜接种量约为2×106CFU/mL。

2.1.3 发酵温度的确定 不同温度下分别恒温发酵18 h后酶解山药浆活菌数和酸度测定结果如图3所示。

图3 发酵温度对酶解山药浆活菌数、滴定酸度和pH的影响

由图3可知,在接种量和发酵时间相同的情况下,不同发酵温度下的酶解山药浆在发酵终止时活菌数随发酵温度升高呈先增大后减小的变化趋势。发酵温度过低或过高均会抑制益生菌的生长,导致产品活菌数下降,从而影响产酸能力[21]。当发酵温度为33 ℃时,由于发酵温度较低,导致代谢不活跃,影响活菌数的增长;当发酵温度为41 ℃时,可能是由于发酵温度较高,菌体生长较慢,导致活菌数下降。

酶解山药浆pH随发酵温度升高呈先下降后上升的变化趋势,滴定酸度随发酵温度升高呈先上升后下降的变化趋势。pH和滴定酸度变化与活菌数变化相符合。益生菌生长会受到发酵温度的影响,进而影响发酵的速度及发酵过程中乳酸的积累[22]。综合发酵温度对活菌数、滴定酸度及pH的影响,确定适宜发酵温度约为37 ℃。

2.2 益生菌山药饮料发酵条件响应曲面法优化试验

响应面法优化发酵益生菌山药饮料生产工艺的试验结果如表4所示。

表4 响应面优化试验结果Table 4 Results of response surface optimization test

通过Design-Expert 8.0.6 Trial软件对试验数据进行多元回归拟合,分别得到滴定酸度和活菌数对接种量(A)、发酵时间(B)、发酵温度(C)的二次多元回归方程为:

Y1=107.36+0.97A+3.00B-0.98C-1.16AB-1.45AC-1.16BC-7.94A2-6.84B2-0.46C2

Y2=8.65-0.005A+0.088B+0.012C+AB+0.025AC-0.060BC-0.097A2-0.12B2-0.16C2

对滴定酸度和活菌数两个模型进行方差分析,结果见表5。

表5 回归模型系数显著性检验Table 5 Regression model coefficient significance test

根据回归方程,作响应面图及等高线图,结果见图4～图6。

图4 接种量和发酵温度对滴定酸度影响的响应面图及等高线图

图5 发酵时间和发酵温度对滴定酸度影响的响应面图及等高线图

图6 发酵时间和发酵温度对活菌数影响的响应面图及等高线图

图4显示,随接种量增加,滴定酸度呈先增大后减小的趋势,接种量和发酵温度对滴定酸度影响的响应面坡度比较陡峭,等高线排列较紧密且呈椭圆形,说明接种量和发酵温度之间的交互作用对滴定酸度的影响显著。

图5显示,随发酵时间延长,滴定酸度呈先增大后减小的趋势,发酵时间和发酵温度对滴定酸度影响的响应面坡度比较陡峭,等高线排列较紧密且呈椭圆形,说明发酵时间和发酵温度之间的交互作用。

图6显示活菌数随发酵温度升高和发酵时间延长,呈先增大后减小的趋势。发酵温度和发酵活菌数的影响响应面坡度陡峭程度明显,等高线排列较紧密且呈椭圆形,说明发酵温度和发酵时间之间的交互作用对活菌数的影响显著,此表现与模型得出p值一致。

通过上述回归模型,采用响应面分析优化后获得益生菌山药饮料最佳发酵工艺条件为:2.02×106CFU/mL、发酵时间为19.10 h、发酵温度为36.96 ℃。在该工艺条件下,益生菌山药饮料活菌数理论值可达8.66lg CFU/mL,滴定酸度理论值可达107.53 °T。考虑到实际生产操作,将最佳工艺参数调整为:接种量2×106CFU/mL、发酵时间19.1 h、发酵温度37 ℃。在调整过后所得最佳发酵工艺条件下对其进行验证试验,试验重复三次并取平均值,得出结果测得益生菌山药饮料的实际活菌数为4.3×108CFU/mL,滴定酸度为105.33 °T,与模型预测值较为吻合,说明采用响应面法优化得到的益生菌山药饮料发酵工艺条件准确可靠,可用于实际操作。

2.3 益生菌山药饮料的冷藏稳定性

2.3.1 活菌数和酸度的变化 由表7可以看出,pH在4 ℃贮藏28 d期间均保持在3.71±0.10范围内不变;滴定酸度在4 ℃贮藏28 d期间随贮藏天数增加不断升高;样品中益生菌总活菌数在4 ℃贮藏28 d期间始终稳定在 108CFU/mL以上,28 d时最低,约为3.43×108CFU/mL。该饮料样品在贮藏期内滴定酸度及活菌数变化规律与陈世贤等研究相符合[23]。

表7 益生菌山药饮料样品在4 ℃、28 d贮藏期内活菌数、pH及滴定酸度的变化Table 7 Changes of viable bacteria counts and acidity of probiotic yam beverage samples during storage at 4 ℃ for 28 days

2.3.2 感官品质的变化 由图7可知,益生菌山药饮料样品在4 ℃、28 d贮藏期内饮料色泽始终保持淡黄,且澄清透明;饮料组织状态良好,始终无分层现象;贮藏结束时饮料乳酸菌饮料特有的风味明显;随着贮藏时间的增加,酸度有所上升,但综合口感仍在可接受范围之内。综上所述,益生菌山药饮料在贮藏期内组织状态良好、风味及口感稳定。

图7 益生菌山药饮料样品在4 ℃、28d贮藏期内感官评价

3 结论

以山药粉为原料,通过接种益生菌L.plantarumP-8和B.lactisV9进行发酵,研究发酵时间、接种量、发酵温度对益生菌山药饮料中活菌数、滴定酸度以及pH的影响,在此基础上进行响应面优化,通过分析优化得出发酵时间对发酵山药饮料滴定酸度及活菌数影响最大。经回归分析并结合实际生产操作可行性后确定发酵益生菌山药饮料最优生产工艺条件为接种量2×106CFU/mL、发酵时间19.1 h、发酵温度37 ℃,在此条件下益生菌山药饮料活菌数为4.3×108CFU/mL,滴定酸度为105.3 °T。对益生菌山药饮料进行4 ℃、28 d贮藏实验,结果表明:pH在4 ℃贮藏28 d期间均保持在3.71±0.1范围内,与目前市售的活性乳酸菌饮料pH无显著性差异;贮藏期间饮料益生菌总活菌数基本维持在108CFU/mL,且贮藏结束后饮料组织状态稳定,质地保持均匀,无沉淀及分层现象。在此条件下发酵后制得益生菌山药饮料色泽淡黄,澄清透明,且香气浓郁、口感清爽,是一种兼具丰富营养价值与良好益生功能的活性益生菌饮料,具有良好的开发前景。