添加蔗糖对裸燕麦酵素发酵过程中理化指标与活性成分变化的影响

唐思煜,翁云丹,毛 舸,蔡成岗,2,3,*,毛建卫,2,3,*

(1.浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室,浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心,浙江科技学院生物与化学工程学院,浙江杭州 310023;2.浙江大学生物系统工程与食品科学学院,浙江杭州 310058)

燕麦是谷类中最好的全价营养食品之一,能够治疗和预防心脑血管疾病[1]、糖尿病[2]和肥胖病[3],同时还具有改善便秘[4]、促进伤口愈合[5]、预防骨质疏松的功效。燕麦中蛋白质含量一般为13%～17%[6],氨基酸的含量均衡,且赖氨酸含量高;燕麦籽粒脂肪[7]含量约为5%～7%,其中非不饱和脂肪酸所占比例大[8];燕麦还含有丰富的膳食纤维和维生素E、B1和B2等,具有很高的营养保健价值。

食用植物酵素是以一种或多种新鲜蔬菜、水果、谷豆类、海藻类、药食两用本草类等食材为原料,加(或不加)糖类物质,经多种有益菌通过较长时间发酵而生产的功能性微生物发酵产品[9-12]。随着人们保健意识的增强,酵素受到了广泛关注,酵素种类呈多样化发展。发酵加工不仅保留了原料本身的营养成分,而且在发酵过程中通过菌种生长代谢产生新的活性物质,如氨基酸、酶、维生素、酚类等[13-14],促进谷物酵素抗氧化、调节肠道平衡、增强免疫、减肥、解酒、抗菌、促进伤口愈合等[15-19]功能。此外,发酵加工可以延长谷物产品的货架期,改善品质结构和口感,提高食品的营养价值,同时产生丰富的风味物质[20],使其更容易被大众接受,是一种具有研发前景的高附加值加工方法。

目前国内外的燕麦产品除了燕麦片、燕麦粥之外,还有通过发酵制得的燕麦乳酸饮料、燕麦面包、燕麦酸奶、燕麦啤酒[21-26]等,但是以裸燕麦种子为单一原料进行酵母发酵生产酵素的研究鲜见报道。本实验以裸燕麦种子为原料,添加纯种酵母菌促进酵解,添加糖类成分加速发酵,同时对比不添加糖类成分的裸燕麦种子发酵,选择多酚含量为功能性成分指标、还原糖和酒精含量为发酵进程指标,并对基本营养成分可溶性蛋白质含量进行测试,以考察不同发酵阶段各物质成分的变化情况,为新型裸燕麦酵素工艺优化及产品开发提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

菌种:安琪活性干酵母 安琪酵母股份有限公司;山西裸燕麦 太谷县绿宝种业有限公司;蔗糖 市售;中性-α-淀粉酶(10000 U/g)、糖化酶(100000 U/g)、福林酚、没食子酸、DNS、氢氧化钠、重蒸酚、无水亚硫酸钠、酒石酸钾钠、碳酸钠、考马斯亮蓝、磷酸、乙醇(均为分析纯) 国药集团化学试剂有限公司;叔丁醇(色谱纯) 阿拉丁化学试剂有限公司。

FA2004电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司;RHP-600型高速多功能粉碎机 浙江荣浩工贸有限公司;UV-5500紫外分光光度计 上海元析仪器有限公司;PHS-3C 数显酸度计 杭州奥利龙仪器有限公司;GC-2010 Pro 岛津企业管理(中国)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 裸燕麦酵素的制作 将拣过杂质、碎粒的裸燕麦种子粉碎,过20目筛,按1∶10加入去离子水,在80 ℃下水浴糊化20 min,加入淀粉酶(相对底物数量添加的酶量为12 U/g),在60 ℃、pH6.0下液化50 min,调节pH至4.5,加入糖化酶(相对底物数量添加的酶量为100 U/g),在65 ℃下糖化50 min。糖化结束后121 ℃高温杀菌20 min,确保样品接种酵母菌后保持纯种发酵状态。将灭菌后的样品分为六个平行,每三个平行为一组,每个平行约10 L,分别装入20 L发酵罐中,各组皆加入5%的活化酵母菌(W/W),一组全加糖(9%,W/W),一组全不加糖,在28 ℃的环境下发酵168 h,每24 h取样。样品在8000 r/min下离心15 min,取上清液-20 ℃下冷冻保存,待测。

1.2.2 指标检测方法

1.2.2.1 还原糖含量测定 标准曲线绘制:吸取0.05、0.01、0.15、0.2、0.25、0.3 mL葡萄糖标准溶液(1 mg/mL)于10 mL试管中,用去离子水补至1 mL,加入3 mL的DNS试剂,混匀后在沸水浴中加热5 min,冷却后定容至10 mL,放置30 min,在520 nm下测定吸光度,以去离子水作为空白对照。

样品测定:准确吸取待测液,按照标准曲线步骤操作测定吸光度,并根据标准曲线计算发酵液中还原糖含量(以葡萄糖计)。

1.2.2.2 pH测定 使用PHS-3C数显酸度计进行测定,每个样品平行三次。

1.2.2.3 酒精含量测定 参照GB 5009.225-2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》[27]中方法进行测定。

1.2.2.4 可溶性蛋白含量测定 裸燕麦酵素中可溶性蛋白含量(以牛血清蛋白计)测定采用考马斯亮蓝法[28]。准确吸取0、0.06、0.10、0.14、0.18、0.20 mL 1 mg/mL牛血清蛋白溶液,加入0.15 mg/L的NaCl溶液至1 mL,加入考马斯亮蓝试剂5 mL,避光反应10 min,于595 nm波长下测定吸光度。样品测定:准确吸取待测液,按照标准曲线步骤操作测定吸光度,并根据标准曲线计算发酵液中可溶性蛋白含量(以牛血清蛋白计)。

1.2.2.5 总酚含量测定 参照文献[29]方法稍作修改。标准曲线绘制:配制0、100、200、300、400、500 μg/mL没食子酸标准溶液,取0.1 mL于10 mL离心管中,加入5 mL去离子水,0.5 mL 1 mol/L Folin-Ciocalteau试剂,混匀静置8 min后,加入7.5 g/100 mL的Na2CO3溶液4 mL,充分混匀后在25 ℃水浴遮光静置1 h,于765 nm波长处测定其吸光度,以去离子水做空白。样品测定:准确吸取待测液,按照标准曲线步骤操作测定吸光度,并根据标准曲线计算发酵液中总酚含量(以没食子酸计)。

1.3 数据统计与分析

试验中每个样品做三个平行,每个处理重复三次,数据以平均值±标准差的形式呈现,采用SPSS 24.0数据处理,使用T检验、相关性分析对数据进行综合比较。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

2.1.1 还原糖含量标准曲线 如图1所示,还原糖含量的标准曲线为y=2.0236x-0.1268(R2=0.9997)。

图1 还原糖含量的标准曲线

2.1.2 酒精含量标准曲线 如图2所示,乙醇/叔丁醇浓度的标准曲线为y=0.0039x-0.0163(R2=0.9996)。

图2 乙醇/叔丁醇浓度的标准曲线

2.1.3 可溶性蛋白标准曲线 如图3所示,得可溶性蛋白含量标准曲线为y=3.9544x+0.2326(R2=0.9999)。

图3 可溶性蛋白含量的标准曲线

2.1.4 多酚含量标准曲线 如图4所示,得回归方程为y=1.5315x+0.0183(R2=0.99895)。

图4 总酚含量的标准曲线

2.2 添加蔗糖对裸燕麦酵素中理化指标和活性成分的影响

2.2.1 添加蔗糖对裸燕麦酵素中还原糖含量的影响 添加蔗糖对裸燕麦酵素中还原糖含量变化见图5。发酵0 h时添加蔗糖与不添加蔗糖的发酵液中还原糖浓度差最大,为16.53 mg/mL,之后浓度差减小。这是因为酵母菌进入对数生长期,种群数量剧增,营养消耗剧大,还原糖浓度迅速下降,随着发酵时间的延长,加糖裸燕麦酵素在72 h到达最低点,还原糖含量为4.45 mg/mL,之后有略微回升。这可能是因为蔗糖的添加促使酵母菌繁殖速度加快,相比不加糖样品更快进入发酵后期,酵母菌死亡速度超过繁殖速度,糖类物质消耗速度减缓,死亡的菌体溶解于发酵液导致还原糖含量有所上升。而不加糖酵素在48 h后趋势平缓下降,168 h时样品中还原糖含量达到3.15 mg/mL。蔗糖添加与否对于裸燕麦酵素还原糖含量变化影响不明显。

图5 添加蔗糖对裸燕麦酵素中还原糖含量的影响

沈昌等[30]接种10%的酵母菌发酵糙米汁、麦芽汁和黄豆芽汁混合液48h,还原糖含量在18 h达到最低,之后趋于稳定。杜庆爽[31]在红枣汁中接种5%的不同酵母于27 ℃下发酵7 d,结果表明,10种酵母菌发酵液中还原糖含量变化趋势相同,在0～2 d内还原糖含量急剧下降,之后速度趋缓,直至基本保持不变。这些研究均与本文结果一致。在生长初期,酵母菌需要利用还原糖使自身菌体浓度增加,酵母菌的大量繁殖也促使还原糖进一步被快速消耗。

2.2.2 添加蔗糖对裸燕麦酵素pH的影响 添加蔗糖对裸燕麦酵素pH含量影响的变化如图6所示。高温处理后,加糖的燕麦溶液pH较不加糖溶液pH低,可能是高温灭菌过程中,蔗糖水解成部分的葡萄糖,进一步解离成葡萄糖酸,降低了溶液中的pH,另外可能是蔗糖与燕麦中其他成分反应等原因降低了溶液的pH,其原因需要进一步探讨。发酵过程中加糖裸燕麦酵素的pH在发酵过程中始终低于不加糖裸燕麦酵素,两者变化趋势相似,在24 h时pH分别由4.37、5.42降到3.48、4.16,且随着发酵时间的延长趋于稳定。不加糖裸燕麦酵素pH稳定在4左右,而加糖裸燕麦酵素pH在3.5上下浮动。酵母菌通过糖酵解途径和三羧酸循环,在生长期产生大量有机酸等酸类物质,导致pH骤降[30]。

图6 添加蔗糖对裸燕麦酵素pH的影响

2.2.3 添加蔗糖对裸燕麦酵素酒精含量的影响 添加蔗糖对裸燕麦酵素发酵过程中酒精含量的变化对比见图7。由图7可知,不加糖裸燕麦酵素酒精含量发酵48 h时,从0.09%上升到1.48%,48 h后趋于稳定。加糖裸燕麦酵素在72 h时,酒精含量达到最大值5.26%,之后逐渐降低,168 h时酒精含量为4.03%。杜庆爽[31]研究10种酵母菌发酵红枣酒过程中酒精度变化趋势发现,4 d后酒精含量变化较平缓,7 d时酒精含量最高为8.2%,高于本试验所做的裸燕麦酵素。

图7 添加蔗糖对裸燕麦酵素酒精含量的影响

2.2.4 添加蔗糖对裸燕麦酵素可溶性蛋白的影响 图8为添加蔗糖对裸燕麦酵素中可溶性蛋白含量变化的影响。由图8可知,蔗糖含量的添加对裸燕麦酵素发酵过程中可溶性蛋白含量有非常明显的影响。发酵48 h,加糖裸燕麦酵素的可溶性蛋白含量相比发酵前增加23.98%,随着发酵时间的延长,可溶性蛋白含量缓慢上升,发酵168 h时,增加量达到41.52%。与加糖裸燕麦酵素不同,不加糖裸燕麦酵素的可溶性蛋白含量在发酵48 h时下降54.24%,在48 h以后可溶性蛋白含量有所回升,但总体呈下降趋势。蔗糖的添加降低了酵母对燕麦底物营养物质的利用,相比于不加糖样品,酵母菌繁殖后产生大量菌体蛋白,同时大分子蛋白水解成小分子溶于发酵液中,因此整体呈现上升趋势。

图8 添加蔗糖对裸燕麦酵素中可溶性蛋白的影响

沈昌等[30]研究发现,以糙米为主要原料的富硒酵母发酵液在发酵过程中,可溶性蛋白含量迅速降低,18 h后缓慢上升。发酵初期,可溶性蛋白被菌种利用,导致其含量迅速下降,之后含量有所上升,可能是因为菌种死亡自溶引起胞内蛋白质溢出。罗建成等[32]以玉米秸秆为原料经多菌体发酵,发现可溶性蛋白与发酵前相比,增幅为112.4%,与本试验结论类似,说明通过菌种发酵加工可以提高发酵产品中可溶性蛋白的含量。

2.2.5 添加蔗糖对裸燕麦酵素多酚含量的影响 添加蔗糖对裸燕麦酵素发酵过程中多酚含量的变化见图9。发酵0 h时,多酚含量结果相差(0.053±0.01) mg/mL,即(0.053±0.01) g/L,由于试验采用20 L的发酵罐进行发酵,初始成分含量差异可能是由系统误差引起的。由图9可知,添加蔗糖可使裸燕麦酵素多酚含量明显增加。随着发酵时间延长,168 h时加糖发酵的裸燕麦酵素中多酚含量增加12.10%;不加糖发酵的裸燕麦酵素在发酵过程中多酚含量总体呈下降趋势,发酵168 h时多酚含量下降4.13%,此时加糖裸燕麦酵素多酚含量比不加糖裸燕麦酵素高24.23%。

图9 添加蔗糖对裸燕麦酵素中多酚含量的影响

发酵初始,加糖发酵液还原糖浓度为52.98 mg/mL,不加糖发酵液还原糖浓度为36.45 mg/mL。多酚含量的增加可能是因为添加蔗糖提高了发酵液中糖的浓度,促进燕麦中多酚等成分析出;糖类物质促使酵母菌发酵降解燕麦,也使得发酵液中多酚含量增加。没有添加蔗糖的发酵液中碳源相对于添加蔗糖组的少,因此后者样品中有效成分,如多酚类物质可能被酵母菌利用而导致其浓度降低。张敏[33]在酵母菌发酵蜂蜜酒研究中发现,发酵后蜂蜜酒中总酚和总黄酮含量均上升,分别达56.6%和55.4%,随着初始糖度的增加,蜂蜜酒总酚和总黄酮的相对变化量呈逐渐减小趋势。在酸茶酿制过程中,任翠娟等[34]发现酿制至21 d,随着蔗糖添加量的增加,添加量为10%、13%的试验组酿制品茶多酚含量整体呈上升趋势,其余试验组酿制品茶多酚含量随着酿制时间延长呈下降趋势。

王吉成等[35]通过接种冠突散囊菌孢子对桑叶进行固、液态发酵,研究表明发酵后桑叶70%乙醇提取物中总多酚含量均降低,而对于桑叶水提取物,固态发酵降低其总多酚含量,液态发酵则无显著影响。这与本文研究结果不同,可能是相比于酵母菌发酵,冠突散囊菌发酵处理使桑叶中的化合物被转化类型有所不同。

2.3 裸燕麦酵素发酵过程中各指标的相关性分析

添加蔗糖使燕麦中物质含量的相关性产生变化(表1、表2)。多酚与可溶性蛋白(r=0.723)在加糖发酵样品中具有显著正相关性(p<0.05),而在不加糖样品中两者不存在相关性或者相关性极低,多酚与还原糖(r=0.855)、pH(r=0.879)、酒精含量(r=-0.923)存在极显著的相关性(p<0.01)。发酵液中加入糖类物质,酵母菌大量吸收糖类物质并转化为可溶性蛋白和多酚等活性成分。而不加糖发酵液中,多酚、蛋白等随着还原糖一起被酵母菌利用,维持自身生长繁殖。

表1 加糖裸燕麦酵素中各指标之间的相关性分析Table 1 Correlation analysis of the indexes in oat jiaosu with sucrose

表2 不加糖裸燕麦酵素中各指标之间的相关性分析Table 2 Correlation analysis of the substances contents in oat jiaosu without sucrose

此外,加糖发酵样品的可溶性蛋白与酒精含量(r=0.831)具有显著正相关性(p<0.05),与还原糖(r=-0.893)、pH(r=-0.863)具有极显著负相关(p<0.01),与不加糖样品趋势相反。这也说明了添加的蔗糖作为燕麦中营养物质的代替品被酵母菌吸收,从而减少了对燕麦底物本身的消耗,燕麦中的营养成分不断溶解于发酵液中,酵母菌合成相关产物,共同影响发酵液中多酚及可溶性蛋白含量的上升。相似的是,两种样品的酒精含量与pH、还原糖之间都相互存在极显著的相关性(p<0.01)。这说明一定程度的蔗糖添加不会过多影响酵母菌对还原糖的利用和酒精的产出。

3 结论

本研究通过添加蔗糖是否对裸燕麦酵素中理化和生理活性成分产生影响进行初步考察,结果表明,加糖裸燕麦酵素pH始终低于不加糖裸燕麦酵素,还原糖含量在72 h降到最低,相比于不加糖样品更快进入发酵后期。168 h时加糖裸燕麦酵素中酒精含量、可溶性蛋白含量、多酚含量分别高出不加糖裸燕麦酵素205.30%、83.33%、24.23%。蔗糖的添加也影响各指标间的相关性。多酚与可溶性蛋白、可溶性蛋白与酒精含量在加糖发酵样品中具有显著(p<0.05)正相关性;而不加糖样品中多酚与其余指标、可溶性蛋白与还原糖、pH之间存在显著(p<0.01或p<0.05)的相关性。添加蔗糖可以降低酵母菌对燕麦营养物质的消耗,同时转化出有效的活性成分,相比于不添加蔗糖的裸燕麦酵素发酵更快,更有利于营养物质的析出和活性成分的富集。实验结果同样说明蔗糖添加量可以作为裸燕麦酵素工艺的一个考察因素,其添加量等相关因素将在下一步酵素工艺优化试验中进行考察。