卵巢癌患者组织及外周血CD8+T细胞中调节性T细胞相关分子标志物的表达及意义

卢永红

在各类妇科肿瘤中，卵巢癌的致死率位居首位，只有25%～30%的5年生存率，对女性的健康及生命安全造成了严重威胁[1]。要想将卵巢癌的发生发展机制阐明，关键是要对卵巢癌患者的免疫状态进行分析[2]。本研究探讨了卵巢癌患者组织及外周血CD8+T细胞中调节性T细胞相关分子标志物的表达及意义，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

随机选取2016年8月至2018年8月我院卵巢癌患者62例，患者年龄27～72岁，平均(51.2±8.6)岁；在病理类型方面，40例为浆液性腺癌，10例为黏液性腺癌，12例为子宫内膜样腺癌；在国际妇产科联盟(FIGO)分期方面[3]，6例为Ⅰ期，8例为Ⅱ期，46例为Ⅲ期，2例为Ⅳ期。另随机选取同期我院卵巢良性肿瘤患者62例，患者年龄25～69岁，平均(47.2±7.2)岁；在肿瘤类型方面，24例为黏液性囊腺瘤，18例为浆液性囊腺瘤，14例为畸胎瘤，6例为巧克力囊肿。另随机选取同期我院健康体检人员62例，年龄27～70岁，平均(48.2±8.3)岁。3组人员的一般资料比较差异均不显著(P>0.05)。

1.2 纳入和排除标准

纳入标准：①均具有完整的临床资料；②均知情同意并签署知情同意书。排除标准：①接受过免疫抑制剂治疗；②接受过化疗治疗；③接受过外科手术治疗。

1.3 方法

1.3.1 单细胞悬液制备 首先将新鲜外周血单个核细胞(PBMC)分离出来，在此过程中将天津灏洋生物公司生产的Ficoll液(淋巴细胞分离液)充分利用起来，PBS重悬细胞浓度到1×106/l。然后将新鲜切取的卵巢癌、卵巢良性肿瘤组织剪碎，规格约为1 mm3，之后将消化液加入其中，其含美国Sigma公司生产的谷氨酰胺、透明质酸钠、DNA酶Ⅰ、Ⅳ型胶原酶，将单个细胞分离出来，途径为在37 ℃的孵箱中进行2 h摇床消化，200目筛网过滤，并将淋巴单核细胞分离出来，在此过程中将Ficoll液充分利用起来，PBS重悬细胞浓度到1×106/l。

1.3.2 抗体染色与流式检测 ①细胞膜表面抗体检测。在美国e-Bioscience公司生产的anti-GITR-PE、美国BD公司生产的anti-CD28-APC、anti-CD25-APC、anti-CD8-FITC抗体中加入100 μl上述细胞悬液，室温下进行20 min的避光孵育，PBS进行2次洗涤，将上清弃去，将300 μl PBS加入，上机检测；②细胞内抗体检测。在anti-CD8-FITC抗体中加入100 μl上述细胞悬液，室温下进行20 min的避光孵育，进行2次洗涤，在此过程中将含FBS的破膜缓冲液充分利用起来，将细胞固定液加入，室温下进行10 min的避光固定，洗涤后将破膜剂加入，室温下进行30 min的孵育，洗涤后将anti-CTLA-4-APC、anti-Foxp3-PE抗体加入，在4 ℃的温度下进行30 min的避光孵育，洗涤后将300 μl PBS重悬加入，检测过程中采用Beckman Gallios流式细胞仪。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 卵巢癌、卵巢良性肿瘤患者组织CD8+T细胞中GITR、GTLA-4、CD28、CD25、Foxp3表达水平比较

卵巢癌患者组织CD8+T细胞中GTLA-4、Foxp3表达水平均显著高于卵巢良性肿瘤患者(P<0.05)，CD28表达水平显著低于卵巢良性肿瘤患者(P<0.05)，但卵巢癌、卵巢良性肿瘤患者组织CD8+T细胞中GITR、CD25表达水平之间的差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 卵巢癌、卵巢良性肿瘤患者组织CD8+T细胞中GITR、GTLA-4、CD28、CD25、Foxp3表达水平比较

2.2 3组人员外周血CD8+T细胞中GITR、GTLA-4、CD28、CD25、Foxp3表达水平比较

卵巢癌患者外周血CD8+T细胞中GTLA-4、CD25、Foxp3表达水平均显著高于卵巢良性肿瘤患者、健康体检人员(P<0.05)，CD28表达水平显著低于卵巢良性肿瘤患者、健康体检人员(P<0.05)；但卵巢良性肿瘤患者、健康体检人员外周血CD8+T细胞中GTLA-4、CD28、CD25、Foxp3表达水平之间的差异均无统计学意义(P>0.05)，卵巢癌、卵巢良性肿瘤患者、健康体检人员外周血CD8+T细胞中GITR表达水平之间的差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 3组人员外周血CD8+T细胞中GITR、GTLA-4、CD28、CD25、Foxp3表达率比较

2.3 卵巢癌患者外周血CD8+T细胞中GTLA-4、CD28、CD25、Foxp3表达水平和临床病理参数的相关性分析

卵巢癌不同年龄、组织学分型、病理学分级、TNM分期、淋巴结转移患者外周血CD8+T细胞中GTLA-4、CD25表达水平之间的差异无统计学意义(P>0.05)；组织学分型黏液性腺癌、子宫内膜样腺癌、浆液腺腺癌患者外周血CD8+T细胞中CD28表达水平逐渐降低(P<0.05)，但不同年龄、病理学分级、TNM分期、淋巴结转移患者外周血CD8+T细胞中CD28表达水平之间的差异均无统计学意义(P>0.05)；TNM分期Ⅲ/Ⅳ期、有淋巴结转移患者外周血CD8+T细胞中Foxp3表达水平显著高于Ⅰ/Ⅱ期、无淋巴结转移患者(P<0.05)，但不同年龄、组织学分型、病理学分级患者外周血CD8+T细胞中GTLA-4、CD28、CD25表达水平之间的差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 卵巢癌患者外周血CD8+T细胞中GTLA-4、CD28、CD25、Foxp3表达率和临床病理参数的相关性分析

3 讨论

调节性T细胞(Treg)在机体肿瘤免疫中将重要作用发挥了出来，是成熟T细胞亚群，具有免疫抑制功能[4]。现阶段，CD4+Treg是Treg研究的主要方向，但是CD8+Treg在Treg研究中却较为少见[5]。近年来，越来越多的相关医学研究表明[6-10]，在肿瘤、自身免疫性疾病等中，CD8+Treg具有重要的免疫调节作用。相关医学研究表明[11-13]，与健康人、卵巢良性肿瘤患者相比，卵巢癌患者具有显著较高的组织、外周血CD8+Treg比例，同时，CD8+T 细胞中Foxp3表达率可能能够将一定依据提供给临床对卵巢癌进展状况的了解。本研究结果表明，卵巢癌患者组织CD8+T细胞中GTLA-4、Foxp3表达率均显著高于卵巢良性肿瘤患者(P<0.05)，CD28表达率显著低于卵巢良性肿瘤患者(P<0.05)。卵巢癌患者外周血CD8+T细胞中GTLA-4、CD25、Foxp3表达率均显著高于卵巢良性肿瘤患者、健康体检人员(P<0.05)，CD28表达率显著低于卵巢良性肿瘤患者、健康体检人员(P<0.05)。卵巢癌组织学分型黏液性腺癌、子宫内膜样腺癌、浆液腺腺癌患者外周血CD8+T细胞中CD28表达率逐渐降低(P<0.05)；TNM分期Ⅲ/Ⅳ期、有淋巴结转移患者外周血CD8+T细胞中Foxp3表达率显著高于Ⅰ/Ⅱ期、无淋巴结转移患者(P<0.05)，和上述相关医学研究结果一致。

总之，卵巢癌患者组织及外周血CD8+T细胞中调节性T细胞相关分子标志物表达异常，能够将一定依据提供给临床对卵巢癌进展状况的了解，值得临床充分重视。