鸡蛋中磺胺二甲基嘧啶残留快速分析方法

黄晓梅 ，苏秋权 ，李亚菲 ，王威利 ，殷秋妙 ，伍健光 ，吴维煇

（1.广东省农业科学院农产品公共监测中心，广东 广州 510640；2.农业农村部农产品质量安全风险评估实验室（广州），广东 广州 510640；3.广东食品药品职业学院，广东 广州 510520）

【研究意义】鸡蛋的营养主要来源于蛋清与蛋黄，二者的营养价值不同，其相关制品受到不同人群的青睐。例如，蛋清富含蛋白质，是普通人群补充蛋白的重要来源，也是烘焙制品的重要原料；蛋黄是蛋挞、饼干、蛋黄派等产品的理想原料。蛋鸡在养殖过程中难免会使用一些兽药来治疗相关疾病，鸡蛋是蛋鸡排出兽药的重要途径，因此，鸡蛋中的兽药残留备受关注。然而，由于蛋清与蛋黄的形成机制不同，可能会导致兽药在蛋清与蛋黄中的兽药残留水平不同。由于蛋清与蛋黄的基质不同，其样品的分析方法存在差异性。例如，在分析磺胺类药物残留时，蛋黄样品经提取后需经除脂步骤［1］。磺胺二甲基嘧啶被广泛应用于预防和治疗畜禽类的抗菌和抗球虫病。但使用磺胺二甲嘧啶后，其在鸡蛋中的残留量很高［2］，因此该药物说明书明确规定蛋鸡产蛋期禁用。但在生产实践中，磺胺二甲基嘧啶仍非法用于蛋鸡，从而导致鸡蛋中药物残留时有发生［3］。本研究以磺胺二甲基嘧啶为例，探讨蛋液（蛋清与蛋黄的混合液）、蛋清、蛋黄中兽药残留分析方法。

【前人研究进展】早期畜禽样品中磺胺二甲基嘧啶的提取和净化方法较为复杂。安胜英等［4］采用C18填料与鸡蛋样品研磨，将其装填至含有无水硫酸钠的小柱，先用正己烷洗脱，除去脂肪等非极性化合物，再用二氯甲烷洗脱目标化合物。近年来，固相萃取法是畜禽样品中磺胺二甲基嘧啶的常用净化方法。李宏娟等［5］采用乙酸乙酯提取和0.1 mol/L盐酸溶剂转换，再用正己烷除脂，然后用MCX柱净化；ZHAO等［6］采用固相萃取柱（填料为多层碳纳米管）对猪肉、鸡肉和鸡蛋样品中磺胺二甲基嘧啶进行净化处理；HOU等［7］采用类似方法处理猪肉样品。虽然固相萃取法能极大程度地降低样品中基质干扰效应，但是该方法较为耗时。以上方法均不适用于大批量样品的快速检测。尽管有文献采用C18分散剂快速实现水产品中磺胺二甲基嘧啶的净化［8］，以及采用QuEChERS快速实现牛奶中磺胺二甲基嘧啶的净化［9］，但二者的耗材相对较为昂贵；也有文献报道了酶联免疫法快速检测肉和蛋中磺胺二甲基嘧啶的方法［3,10］，但是酶联免疫法可能会出现假阳性结果而只适用于初步筛查［11-12］。【本研究切入点】液相色谱-紫外/荧光法是畜禽产品中磺胺二甲基嘧啶的常用检测方法，但是检测限较高［13-15］，不适用于鸡蛋中磺胺二甲基嘧啶（禁用药物）的分析；而液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的灵敏度相对较高［16-17］，可以用于禁用药物的分析。【拟解决的关键问题】本研究利用液液萃取建立蛋液、蛋黄和蛋清中磺胺二甲基嘧啶的快速前处理方法；同时利用高灵敏度和高选择性的高效液相色谱-电喷雾-串联质谱（HPLCESI-MS/MS）对样品中磺胺二甲基嘧啶进行检测，以期建立一种磺胺二甲基嘧啶的快速、绿色经济、灵敏的检测方法，为大批量鸡蛋中禁用药物——磺胺二甲基嘧啶的检测提供一种可靠的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

甲醇（色谱纯，德国默克公司），乙腈和正己烷（分析纯，广州化学试剂厂）；尼龙66滤膜（天津津腾公司），塑料离心管（美国Corning CentriStar公司），涡旋仪（美国Labnet公司），5804R台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司），KQ-250DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），液相色谱-三重四级杆串联质谱联用仪（8040 HPLC-MS/MS，日本岛津公司），ACE UltraCore 2.5 SuperC18反相色谱柱（100×2.1 mm id，英国ACE公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集与制备 鸡蛋样品于2017年7月采自广州市不同的农贸市场和超市，同时记录样品的产地、供货商等信息。对鸡蛋分离出蛋黄和蛋清；蛋液、蛋黄、蛋清样品均采用匀浆机匀浆后置于-20℃冰箱中保存。

1.2.2 样品前处理 蛋液、蛋黄、蛋清样品恢复至室温后，称取1.0 g置于50 mL塑料离心管。加入500 μL水稀释样品；加入8 mL乙腈，涡旋30 s，超声10 min，5 000 r/min离心5 min，取上清液于15 mL塑料离心管。上清液水浴（40 ℃）中氮吹至0.5 mL，加入乙腈-0.1%甲酸水溶液（1∶9，V/V）至2 mL，涡旋30 s，10 000 r/min离心10 min。蛋清样品，取1 mL上清液过滤膜，经HPLC-MS/MS检测磺胺二甲基嘧啶的浓度；蛋黄和蛋液样品，取1.5 mL上清液于2.0 mL塑料离心管，加入正己烷（300 μL），涡旋30s，10 000 r/min离心5 min，取下层水相过滤膜，经HPLC-MS/MS检测磺胺二甲基嘧啶的浓度。

1.2.3 基质匹配标准系列工作液的制备 取空白的蛋液、蛋黄、蛋清样品，按照1.2.2步骤操作，得到空白基质溶液。取空白蛋液、蛋黄、蛋清基质溶液适量，加入适量磺胺二甲基嘧啶标准品，采用逐渐稀释法分别配制蛋液、蛋黄和蛋清基质标准曲线（0.5、1、2、5、10、50、100 ng/mL），以基质标准品的峰面积为横坐标、浓度水平为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.4 仪器分析 基于本课题组建立的HPLC-MS/MS测定氟喹诺酮类药物方法［18］，建立HPLCMS/MS测定磺胺二甲基嘧啶方法。ACE UltraCore 2.5 SuperC18反相色谱柱（100×2.1 mm id，英国ACE公司），柱温40 ℃，进样量为10 μL，流动相组成为0.1%甲酸水溶液（A）和甲醇（B），流速为0.3 mL/min，流动相梯度如表1所示。质谱分析采用正离子电喷雾离子源（ESI）和多重离子裂解监测模式（MRM），离子化电压为4 500 V，去溶剂化和加热板温度分别为250 ℃和400 ℃，雾化气和干燥气流量分别为3 mL/min和15 mL/min。磺胺二甲基嘧啶的定性和定量离子对分别为m/z 279.15→186.05和m/z 279.15→92.05。

1.2.5 方法准确度和精密度考察 在空白蛋液、蛋黄和蛋清中分别添加低、中、高3个不同浓度的磺胺二甲基嘧啶进行加标回收试验，各浓度3个平行实验，3次重复，求平均回收率及批内、批间相对标准偏差。

表1 磺胺二甲基嘧啶色谱分离的流动相梯度Table 1 Gradient mobile phases for the chromatographic separation of sulfamethazine

2 结果与分析

2.1 标准曲线与检测限

蛋液、蛋清、蛋黄中磺胺二甲基嘧啶的基质匹配标准曲线如图1所示。磺胺二甲基嘧啶在相应浓度范围内线性良好，相关系数平方值R2＞999。根据待测物信噪比（S/N）≥3为方法检测限，S/N≥10为方法定量限的原则，测得磺胺二甲基嘧啶在蛋液、蛋黄和蛋液中的方法检测限为0.5 ng/g，方法定量限为1.0 ng/g。

2.2 回收率与重现性

本研究采用蛋液、蛋黄和蛋清进行基质加标回收试验，表2列出了磺胺二甲基嘧啶在3种基质中不同添加水平的平均回收率。蛋液、蛋黄和蛋清中磺胺二甲基嘧啶的平均回收率分别为 78.4%～85.2%、77.9%～89.0%、83.0%～88.1%，批内变异系数分别为3.7%～5.9%、2.8%～5.3%、2.9%～11.5%，批间变异系数分别为4.0%～9.7%、4.8%～9.2%、5.4%～13.8%，表明本研究建立的分析方法稳定可靠。

将本方法与文献报道的生物样品中磺胺二甲基嘧啶分析方法进行比较（表3）可知，本方法具有良好的加标回收率和较低的方法检测限，能满足实际样品测定的要求。

2.3 实际样品分析

将本研究方法应用于广州市15例鸡蛋样品中磺胺二甲基嘧啶的分析，仅1例鸡蛋样品检测到磺胺二甲基嘧啶，蛋液、蛋黄、蛋清中磺胺二甲基嘧啶的含量分别为0.66、0.94、0.47 ng/g。图2是蛋液、蛋黄、蛋清中磺胺二甲基嘧啶的典型色谱图。

3 讨论

图1 磺胺二甲基嘧啶的基质匹配标准曲线拟合结果Fig.1 Matrix matching standard curve fitting of sulfamethazine

图2 蛋液、蛋黄、蛋清中磺胺二甲基嘧啶的典型色谱图Fig.2 Typical chromatograms of sulfamethazine in whole eggs, yolks, and albumens

3.1 提取方法的优化

鸡蛋样品，尤其是蛋清样品，蛋白质含量相对较高，在提取时直接加入提取剂（乙腈）后，样品迅速结块，易包裹目标化合物，致使回收率降低且重复性不好。为了解决该问题，本研究在加入提取剂之前，加入0.5 mL水稀释样品，且在轻微震荡状态下加入提取剂，然后马上涡旋，能有效避免样品结块的现象。本研究考察了提取溶剂的体积和提取次数对提取效率的影响。结果显示，8 mL提取体积与10 mL提取体积的回收率（85%～89% vs 86%～89%）相当，均高于5 mL提取体积（71%～73%）；相同提取体积条件下，一次提取与二次提取的回收率类似，但是二次提取时在后期正己烷除脂时存在乳化现象。因此，本研究将提取剂的体积设定为8 mL，提取次数设定为1次。

表2 蛋液、蛋黄、蛋清中添加不同浓度磺胺二甲基嘧啶的回收率Table 2 Recoveries of sulfamethazine with various addition concentrations in whole eggs, yolks, and albumens

表3 本研究方法与已报道的磺胺二甲基嘧啶分析方法的检测限与加标回收率比较Table 3 Comparison of detection limit and recovery between this method and the reported sulfamethazine detection method

3.2 净化方法的优化

大多数研究采用固相萃取小柱来净化样品［5-7］，较为耗时，不适合大批量样品的分析。本研究根据磺胺二甲基嘧啶难溶于非极性溶剂正己烷，利用正己烷除去蛋液和蛋黄中脂肪等非极性杂质。净化方法较为简洁，适合大批量样品的分析。蛋清的脂肪含量极低，不需要净化，可直接进行仪器分析。

3.3 仪器方法的建立

鸡蛋中磺胺二甲基嘧啶的含量采用HPLCMS/MS检测。首先对磺胺二甲基嘧啶化合物进行全扫描（Full scan, m/z 50～500），确定目标化合物的特征离子；然后将特征离子作为母离子，进行子离子扫描，确定该目标化合物的定性和定量离子对；最后，通过MRM模式，对化合物的碰撞能等参数逐一优化，使其达到最优。最终确定磺胺二甲基嘧啶的定性和定量离子对分别为m/z 279.15→186.05和m/z 279.15→92.05，碰撞能分别为-16 V和-30 V。

4 结论

蛋黄与蛋清的基质不同，导致二者的前处理方法存在差异性。蛋黄的脂肪含量相对较高，需要采取除脂步骤；而蛋清的蛋白质含量相对较高，在提取过程中需加水稀释以防止蛋白质结块包裹目标化合物。本研究采用乙腈溶剂提取、正己烷溶剂除脂的手段，建立鸡蛋的蛋液、蛋黄和蛋清样品的快速前处理方法，同时采用灵敏度高和选择性好的HPLC-MS/MS分析样品中磺胺二甲基嘧啶的含量。本研究的样品前处理方法不需要过柱，操作简洁、耗材低廉、方法灵敏度高，且方法具有良好的加标回收率和较好的重现性，适合大批量蛋液、蛋黄与蛋清样品中磺胺二甲基嘧啶的快速检测。