茂源链霉菌MTG基因pMA5载体的构建及鉴定

陆姣姣 朱婧 穆冬冬 姜绍通 郑志

摘要 [目的]提高MTG产量并实现简便有效的纯化过程，以枯草芽孢杆菌为宿主构建pMA5mtg重组质粒。 [方法]通过提取茂源链霉菌的基因组DNA，扩增mtg基因片段，再将异源信号肽与mtg基因片段进行融合，融合片段和pMA5质粒双酶切后连接，转化到大肠杆菌感受态细胞中，菌落PCR和测序获得阳性单克隆。然后将pMA5mtg重组质粒转入枯草芽孢杆菌感受态中，通过抗性筛选和双酶切鉴定获取重组菌株。 [结果]成功扩增出mtg基因片段，构建出重组质粒pMA5mtg。 [结论]获得pMA5mtg重组表达菌株，为MTG的纯化及其未来生物工程的改造提供了有效的方法。

关键词 MTG;信号肽;载体;枯草芽孢杆菌

中图分类号 S188;Q785文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）13-0092-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.13.030

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Construction and Identification of pMA5 Vector of Streptoverticillium mobaraensis MTG Gene

Abstract [Objective]In order to increase the MTG yield and achieve a simple and effective purification process，the recombinant vector pMA5mtg was constructed and expressed in Bacillus subtilis.[Method]The mtg gene fragment was amplified from the genomic DNA of Streptoverticillium mobaraensis，and the heterologous signal peptide was fused in front of the mtg gene fragment.The fusion fragment and the pMA5 vector were digested and ligated，and then transformed into E.coli competent cells.The positive strains were identified by PCR and extracted to check by DNA sequencing.The recombinant vector pMA5mtg was then transformed into the competent cells of B.subtilis，then the recombinant strain was obtained by resistance screening and double restriction enzyme digestion.[Result]The mtg gene fragment was successfully amplified，and the recombinant vector pMA5mtg was constructed.[Conclusion]The recombinant expression strain of pMA5mtg was obtained，which provided an effective method for the purification of MTG and its future bioengineering transformation.

Key words MTG;Signal peptide;Vector;Bacillus subtilis

微生物来源的谷氨酰胺转氨酶（MTG）可催化蛋白质间发生交联，经其交联的产品稳定性高，对蛋白酶降解和化学损害具有很高的抵抗力，因此，它们被广泛应用于食品、纺织、材料工程等各个领域[1-3]。但MTG生产成本较高，纯化过程复杂，限制了MTG的应用与发展[4-5]。

土壤微生物枯草芽孢杆菌是食品安全级菌株，具有高效的转录翻译系统，分泌蛋白能力强[6]。笔者运用分子生物学技术构建基因工程菌，扩增mtg基因，与载体pMA5连接，转入枯草芽孢杆菌中，获得MTG重组表达载体，以进一步研究MTG在革兰氏阳性菌中的表达及纯化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料。茂源链霉菌（Streptoverticillium mobaraensis）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）均購自中国微生物菌种保藏中心，再由合肥工业大学分子生物学实验室培养保存。载体构建所用质粒pMA5，大肠杆菌DH5α。

1.1.2 主要试剂。

EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit（TransGen），EasyPure Plasmid MiniPrep Kit（TransGen），EasyPure PCR Purification Kit（TransGen），EasyPure Quick Gel Extraction Kit（TransGen），T4-DNA Ligase（TransGen），Enzyme NdeI、NheI（TransGen），Taq DNA Polymerase（Sangon Biotech），FastPfu DNA Polymerase（TransGen），DNA Marker，Tryptone，Yeast extract，NaCl，Agar，Ampicillin，Kanamycin等。

1.2 方法

1.2.1 大肠杆菌DH5α感受态的制备。

取1 mL过夜培养的菌液，转接入100 mL新鲜LB培养基中，37 ℃、200 r/min培养至OD600为0.5～0.8，将培养液在冰上放置30 min，5 000 r/min、10 min、4 ℃离心收集菌体;用100 mL冷水重悬菌体，6 000 r/min、20 min、4 ℃离心去上清，如此漂洗3次;2 mL 10%甘油重悬菌体，7 000 r/min、10 min、4 ℃离心去上清;最后用0.5 mL 10 %甘油重悬菌体，然后将其分装在1.5 mL EP管中，每管50 μL，-80  ℃保存备用。

1.2.2 枯草芽孢杆菌感受态的制备。接种枯草芽孢杆菌于3 mL LB培养基中，过夜培养。取2.6 mL过夜培养物接入40 mL（LB+0.5 mol/L山梨醇）中，37 ℃、200 r/min培养至OD600为0.85～0.95，将菌液冰水浴10 min，然后5 000 r/min、5 min、4 ℃离心收集菌体。用50 mL预冷的电转培养基（0.5 mol/L山梨醇，0.5 mol/L甘露醇，10 %葡萄糖）重新吹悬菌体，5 000 r/min、5 min、4 ℃离心去上清，如此漂洗4次。将洗涤后的菌体吹悬于1 mL电转培养基中，分装在1.5 mL EP管中，每管50 μL ，-80  ℃保存备用。

1.2.3 质粒和基因组DNA的提取。

使用质粒DNA提取试剂盒和细菌基因组DNA提取试剂盒（TransGen）分别进行质粒和基因组DNA提取，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.4 mtg重组表达载体pMA5mtg的构建。

利用Clonemanager软件设计引物，所用引物均在表1中列出。以B.subtilis 168基因组DNA为模板，用引物p1和p2扩增SPwapA信号肽基因片段，将NdeI位点添加到引物p1的5末端。以S.mobaraensis基因组DNA为模板，通过引物p3和p4扩增 mtg片段，将NheI位点添加到引物p4的5末端。引物p2和p3的5末端反向互补配对。再以SPwapA和mtg扩增子的混合物作为模板，用引物p1和p4通过融合PCR扩增片段SPwapA-mtg。将质粒pMA5与融合片段SPwapA-mtg分别进行NdeI和NheI双酶切反应，酶切产物切胶回收，连接转化至E.coli DH5α中，菌落PCR筛选阳性克隆，再将重组质粒提取进行测序。将测序正确的重组质粒转入枯草芽孢杆菌中。

1.2.5 大肠桿菌的电转化。

取出-80 ℃冰箱存储的大肠杆菌DH5α感受态细胞，置于冰上解冻。解冻后，吸取2 μL质粒或连接产物加入到感受态细胞中，混匀，吸取至已预冷的0.2 cm电击杯中，200 Ω、2.5 kV进行电击，电击后迅速加入1 mL无菌未加抗性的LB液体培养基，放在37 ℃摇床中低速振荡培养1.5 h。待菌液混浊后，涂布于LB+氨苄霉素的平板上。平板倒置放于37 ℃培养箱中培养过夜。

从平板上挑取单菌落，进行菌落PCR鉴定，鉴定正确的阳性克隆接种于LB+氨苄霉素的液体培养基中，培养过夜，提取质粒送去公司测序。

1.2.6 枯草芽孢杆菌的电转化。

取出存储于冰箱中的枯草芽孢杆菌感受态细胞，解冻。取2 μL质粒加入到感受态细胞中，混匀，吸取至已预冷的0.2 cm电击杯中，200 Ω、2.5 kV进行电击，电击后迅速加入1 mL无菌未加抗性的RM培养基（LB+0.5 mol/L山梨醇+0.38 mol/L甘露醇），37 ℃摇床培养1.5 h至混浊。涂布于LB+卡那霉素的平板上，37 ℃培养过夜。

从平板上挑取单菌落，接种于LB+卡那霉素的液体培养基中，培养过夜，提取质粒，进行NdeI和NheI双酶切验证，所切条带与理论大小一致时，再将质粒送去测序，最终获得阳性重组菌株。

2 结果与分析

2.1 SPwapA信号肽的扩增

为了保证mtg基因在枯草芽孢杆菌中进行分泌表达，需要信号肽指导其分泌。以B.subtilis 168基因组DNA为模板，扩增SPwapA信号肽基因片段。电泳结果如图1所示，SPwapA长度130 bp，与PCR所得片段大小一致。

2.2 S.mobaraensis mtg的扩增

以S.mobaraensis基因组DNA为模板，扩增mtg基因片段。电泳结果如图2所示，mtg长度1 200 bp，与PCR所得片段大小一致。

2.3 SPwapA与mtg的融合

以SPwapA和mtg扩增子混合物作为模板，用引物p1和p4通过融合PCR扩增片段SPwapA-mtg。SPwapA片段长度为130 bp，mtg片段长度为1 200 bp，故融合片段SPwapA-mtg长度应为1 330 bp。电泳结果见图3，融合片段1 330 bp比片段mtg略长，与PCR所得片段大小一致。

2.4 连接和大肠杆菌转化后阳性克隆鉴定

质粒pMA5与融合片段SPwapA-mtg分别进行NdeI和NheI双酶切反应，酶切产物切胶回收，再用T4连接酶连接，将连接产物转化至E.coli DH5α中，过夜培养后挑取单菌落，进行菌落PCR验证，使用引物p1和p4，扩增目的片段SPwapA-mtg，SPwapA长度130 bp，mtg长度1 200 bp。电泳结果如图4所示，目的片段总长度1 330 bp，与PCR所得片段大小一致，说明片段SPwapA-mtg成功插入到载体pMA5上。将PCR鉴定正确的阳性克隆接种于LB+氨苄霉素的液体培养基中，培养过夜，提取质粒送去公司测序。

2.5 雙酶切验证

将测序正确的pMA5mtg重组质粒转入枯草芽孢杆菌中，在抗性平板上涂布并培养过夜，挑取单克隆接种于LB+卡那霉素的液体培养基中培养过夜，提取质粒，进行NdeI和NheI双酶切验证。电泳结果如图5所示，重组质粒pMA5mtg经双酶切作用后有2条清晰的条带，较小的片段大小为1 300 bp左右，较大的片段为7 100 bp左右，与SPwapA-mtg大小（1 330 bp）和pMA5片段大小（7 107 bp）相符，且其DNA片段测序结果显示所插入的序列完全正确。

3 讨论

谷氨酰胺转氨酶是催化蛋白质或多肽间发生共价交联反应的转移酶，可促进蛋白质凝胶化，在食品、医药、化妆品等领域有广泛应用[7-8]。微生物来源的谷氨酰胺转氨酶是目前研究的热点，但存在成本高、活力低、稳定性差等问题[9]。利用分子生物学技术对MTG基因进行改造并实现异源表达是目前最为有效的方法[10-11]。

该试验通过基因工程技术在大肠杆菌中构建pMA5mtg重组载体，再将其转入枯草芽孢杆菌中，从而获得重组表达菌株。这为MTG在革兰氏阳性菌中的表达研究提供了依据，同时也证明了枯草芽孢杆菌作为异源蛋白工业生产的宿主具有很大的潜力，是一个有意义的研究性课题。

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