Zebularine对乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞增殖和SARI表达的影响

孙艳　陈绍仁　蒋瑞雪　刘继鑫　孙艳宏 姚淑娟　吕丽艳　张春晶

【摘要】 目的：探讨Zebularine对乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞增殖和SARI表达的影响。

方法：选用MDA-MB-231细胞株，分别通过不同浓度的Zebularine作用细胞株24 h后收集细胞，运用MTT法测定Zebularine对乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞的增殖;通过Western Blot检测Zebularine对乳腺癌细胞株SARI的表达。结果：随着药物浓度的增加，Zebularine能够明显抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-231的增殖（P<0.05），Zebularine能够显著提高乳腺癌细胞株MDA-MB-231 SARI蛋白的表达（P<0.05）。结论：Zebularine通过抑制乳腺癌细胞增殖，促进SARI蛋白的表达，从而发挥肿瘤抑制作用。

【关键词】 Zebularine; 乳腺癌; SARI; 增殖

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of Zebularine on the proliferation and SARI expression of human breast cancer cell line MDA-MB-231.Method：MDA-MB-231 cell line were cultured in vitro and treated with different doses Zebularine for 24 hours.MTT method was used to detect the cell proliferation，and western blot was used to detect the expression of SARI in human breast cancer cell line MDA-MB-231.Result：Different doses Zebularine could significantly inhibit the proliferation of human breast cancer cell line MDA-MB-231 with the increase of drug concentration（P<0.05）.Zebularine could obviously reduced the expression of SARI in human breast cancer cell line MDA-MB-231（P<0.05）.Conclusion：Zebularine might inhibit the proliferation，improve the expression of SARI，then inhibit the malignant proliferation of tumor cells，then exerting tumor inhibitory effect.

【Key words】 Zebularine; Breast cancer; SARI; Proliferation

First-authors address：School of Medicine and Technology，Qiqihar Medical University，Qiqihar 161000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.13.007

乳腺癌是我国女性常见的恶性肿瘤，其发病率位居女性恶性肿瘤第一位，我国每年被确诊为乳腺癌的患者约有160万左右，而因乳腺癌死亡的患者超过120万[1]。SARI（suppressor of AP-1 regulated by IFN）又名BATF2，其在星形胶质细胞、黑色素细胞、乳腺细胞以及前列腺上皮细胞等多种正常组织细胞中均有表达，但在对应的肿瘤组织细胞中低表达或表达缺失[2]。研究发现，启动子DNA甲基化是肿瘤细胞中抑癌基因表达下调或者失活的主要机制之一，因此去甲基化药物在治疗肿瘤方面具有广阔的临床前景。5-氮杂-2-脱氧胞苷是传统的去甲基化药物，主要用于恶性肿瘤的临床治疗，但其具有较强的细胞毒性和致突变性，患者不良反应严重。而Zebularine是一种新型去甲基化药物，其成分为胞苷类似物，与传统的去甲基化药物5-氮杂-2-脱氧胞苷相比，具有高效低毒等特性，对于肿瘤细胞选择性高并且能够提高放化疗敏感性[3-4]。本研究以人乳腺癌MDA-MB-231细胞株作为研究对象，应用MTT法和Western Blot等技术观察Zebularine对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和SARI蛋白表达的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 乳腺癌细胞株MDA-MB-231（购于中国科学院上海细胞生物学研究所）。仪器和试剂：酶标仪（瑞士帝肯公司）、电子天平（梅特勒-托利多公司）、高压灭菌锅（上海三申医疗器械有限公司）、低温离心机（德国eppendorf公司）、MTT和Zebularine（购于Sigma公司）、SARI抗体（购于武汉三鹰生物技术有限公司）、GAPDH抗体（购于CST公司）、羊抗兔二抗（购于Abcam公司）、L15培养基和胎牛血清（购于Hyclone公司）、胰蛋白酶（购于赛默飞世尔公司）、96孔细胞培养板和6孔细胞培养板（购于Axygen公司）、DMSO（购于索莱宝公司）。

1.2 方法 细胞培养：将冻存的MDA-MB-231细胞于-80 ℃中取出，放入37 ℃水浴锅中顺时针滑动使之解冻，将解冻后的MDA-MB-231细胞液移入15 mL离心管中，并加入9 mL培养基，800 rpm离心3 min，弃去上清液，加入10%胎牛血清L15培养基重悬细胞，放入60 mm培养皿中于5%二氧化碳、37 ℃的细胞培养箱中培养。药物处理：将Zebularine溶于完全培养基中分别制成25、50、100、200、400 μmol/L五个浓度的工作液。MTT法检测细胞增殖96孔板每孔铺5000个细胞，加入100 μL培养液，培养于5%二氧化碳、37℃的细胞培养箱中24 h，向每孔加入20 μL MTT溶液，孵育4 h，用酶标仪在490 nm处测定OD值，绘制细胞生长曲线。蛋白提取：（1）弃去培养基，用PBS清洗2次，再加入1 mL PBS，用细胞刮将细胞刮起并收集到1.5 mL離心管中，2 000 r/min离心5 min，弃去上清再加入1 mL PBS，再次离心，弃去上清。（2）将蛋白沉淀置于冰上并加入200 μL RIPA裂解液（加入1%蛋白酶抑制剂），每隔5分钟涡旋一次，涡旋6次后于4℃ 12 000 r/min离心10 min。（3）将上清移入新的1.5 mL EP管中，采用BCA蛋白定量试剂盒测定各样品蛋白浓度。（4）测定浓度后按照1︰3的比例加入4×蛋白上样缓冲液，混匀后于100 ℃水浴锅中加热10 min，取出放置至室温后保存于-80 ℃。Western Blot检测SARI表达：

（1）提前配置12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶，上样后，设置电压为70 V 30 min，待样品通过浓缩胶后将电压改为110 V 1 h，溴酚蓝指示剂到达凝胶底部终止电泳。（2）取出凝胶，依据Marker指示，将目的蛋白所在位置凝胶切下来与PVDF膜制成“转膜三明治”，放入转模槽中100 V电压转膜2 h。（3）转膜结束后，将PVDF膜取出放置于5%脱脂奶粉封闭过夜。（4）将目的蛋白抗体用1×TBST溶液按照1︰1 000的比例稀釋，用PVDF膜放入杂交袋中于37℃孵育4 h，1×TBST溶液洗膜3次（10 min/次）后再将PVDF膜用二抗室温孵育45 min。（5）1×TBST洗膜3次（10 min/次），将ECL显影剂A、B液按照1︰1比例混合配置并滴加在PVDF膜上，应用Biorad凝胶成像系统曝光成像并拍照。

1.3 统计学处理 采用SPSS 21.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Zebularine对乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞增殖的影响 MTT法检测不同浓度（0，25，50，100，200，400 μmol/L）Zebularine对乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞作用48 h后，其抑制率分别为0、（17.34±1.70）%、（24.58±3.20）%、（36.79±2.50）%、（57.54±3.40）%、（71.21±4.10）%，各浓度间进行两两比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图1。

2.2 Zebularine对乳腺癌细胞株MDA-MB-231 SARI蛋白的表达的影响 Western Blot 检测不同浓度Zebularine处理乳腺癌细胞株MDA-MB-231 SARI蛋白的表达，以GAPDH作为内参，运用Image J软件对SARI蛋白灰度值进行分析，不同浓度Zebularine（0、50、100、200 μmol/L）分别处理MDA-MB-231细胞48 h，SARI蛋白灰度值分别为（51.15±10.78）、（157.70±21.32）、（185.22±25.76）、（219.74±31.25），与0 μmol/L Zebularine比较，Zebularine不同浓度处理MDA-MB-231细胞后SARI蛋白表达均升高，差异均有统计学意义（P<0.05），见图2。

3 讨论

肿瘤已经成为严重危害人类健康的恶性疾病之一，2017年我国新发癌症病例已经高达350万例，约占全球范围新发病例的四分之一[5]。乳腺癌是女性常见恶性肿瘤之一，从全球范围来看，女性乳腺癌的整体发病率呈现逐年升高的趋势[6]。2018年发布的《Cancer Statistics，2018》一文中预计美国新发乳腺癌病例数占新发癌症的30%，位居第一，高出第二的肺癌8%，预计死于乳腺癌的人数占比14%，位居第二[7]。2015年国家癌症中心统计的数据显示，乳腺癌无论从发病率还是病死率都已经排在了城市女性恶性肿瘤之首，预计到2030年新发乳腺癌病例将达到23.4万例/年以上，死于乳腺癌的女性或超过7万人，病死率提高到47.94%[8-9]。

抑癌基因启动子甲基化能够导致抑癌基因的表达减少或者失活，诱导细胞癌变，是现阶段研究肿瘤发生机制的热点之一。DNA甲基化是通过DNA甲基转移酶（DNA methyltrransferases，DNMTs）来实现的，而去甲基化药物能够抑制DNMTs酶活性，使抑癌基因启动子DNA去甲基化，恢复抑癌基因表达，最终达到治疗肿瘤的目的[10]。5-氮杂-2-脱氧胞苷是传统的去甲基化药物，是一种特异性的DNMTs抑制剂，在临床上主要用于恶性肿瘤的治疗，但因其具有较强的细胞毒性和致突变性限制了其临床应用[11]。而Zebularine是一种新型去甲基化药物，它也通过抑制DNMTs酶活性发挥作用，它与传统的去甲基化药物相比，具有高效低毒等特性，对于肿瘤细胞选择性高并且能够提高放化疗敏感性[12]。研究表明，Zebularine能够抑制DNMT对P16、P21、P53等基因的甲基化作用，抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞的凋亡[13-15]。熊辉等[16]研究显示，Zebularine能够抑制胆管癌细胞系QBC939细胞增殖，通过下调抗凋亡蛋白Bcl2表达，上调促凋亡蛋白Bax表达促进QBC939细胞凋亡。丁佑铭等[17]通过研究也发现，Zebularine能够抑制肝癌HepG2细胞增殖，并且呈剂量和时间依赖性，Zebularine还能够通过改变线粒体膜电位，下调Bcl2表达，上调Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9和Bax的表达促进肝癌HepG2细胞凋亡。本研究通过MTT实验发现，不同浓度（0，25，50，100，200，400 μmol/L）的Zebularine对乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞作用48 h后，能够明显抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-231的生长，并且其抑制作用随着浓度的增加而增强，说明Zebularine对乳腺癌细胞株MDA-MB-231体外抑制作用明显，能够显著抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-231的增殖，从而达到抑制肿瘤的目的。

SARI基因于2008年被Su等[18]发现的一种抑癌基因，由247个氨基酸残基构成，其又被称作BATF-2。有报道显示SARI基因在结直肠癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、食管癌等癌症组织中的表达均低于与其相对应的癌旁或正常组织[19-22]。在多种正常细胞中也检测到SARI能够稳定表达，而且在对应的肿瘤细胞中并未检测到其表达，说明SARI与肿瘤发生发展存在着密切的关系。Zhang等[23]利用AG490对乳腺癌细胞系MDA-MB-231进行处理，结果发现AG490能够通过上调SARI的表达抑制细胞增殖。王平等[24]研究发现，过表达SARI能够显著抑制人白血病K562细胞的增殖，促进细胞凋亡。本研究发现，SARI蛋白在乳腺癌细胞株MDA-MB-231中低表达，不同浓度（0，50，100，200 μmol/L）的Zebularine能够显著抑制乳腺癌MDA-MB-231中SARI蛋白的表达，说明Zebularine可以通过抑制SARI蛋白在乳腺癌细胞株MDA-MB-231中的表达，从而抑制乳腺癌的发生发展[25]。

综上所述，Zebularine作为一种毒副作用较小的甲基化抑制剂，能够在体外抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞的增殖，促进SARI蛋白的表达，但其具体的作用机制和在体内抗乳腺癌的作用还需要深入研究[26-27]。

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（收稿日期：2018-12-27） （本文编辑：周亚杰）