基于紫外—红外指纹图谱的淫羊藿根、茎及叶质量研究

徐玉玲， 杨茂春， 姚运秀， 雷燕莉， 郑荣蕾

(成都大学 药学与生物工程学院， 四川 成都 610106)

0 引 言

淫羊藿又名仙灵脾、刚前，是小檗科淫羊藿属植物，始载于《神农本草经》，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效，在我国具有悠久的药用历史[1-2]，临床上常用来治疗骨质疏松、股骨头坏死以及性功能障碍等疾病[3-6].淫羊藿于1963年被收入《中国药典》，其药用部位为茎叶，《中国药典》1977年版更改其药用部位为地上部分，《中国药典》2010年版又更改其药用部位为干燥叶，并沿用至今，而在《中药大辞典》中，淫羊藿与淫羊藿根则被分为两种药材.由此可见，淫羊藿原植物药用部位变化比较大，而据相关文献报道，不同药用部位某些成分含量有差异[7-8].事实上，中药所含成分复杂，几个成分还不足以反应其内在质量差异，指纹图谱可从整体上反映中药的物质基础情况，具有特征性、重现性和可操作性，能同时对多种成分进行质量控制与差异分析，常用于中药质量控制[9-11].为分析淫羊藿根、茎、叶的质量差异，本研究采用紫外分光光度法(UV)[12-14]和红外光谱法(IR)[15-17]对箭叶淫羊藿与柔毛淫羊藿的根、茎、叶等部位的指纹图谱进行差异研究分析，拟为中药材不同用药部位的质量差异研究提供一种新的思路.

1 材料与仪器

1.1 材 料

实验所用药材包括：箭叶淫羊藿10批(批号，0928J1、0928J2、0928J3、0928J4、0928J5、0928J6、0928J7、0928J8、0928J9、0928J0)、柔毛淫羊藿10批(批号，0319R1、0319R2、0319R3、0319R4、0319R5、0319R6、0319R7、0319R8、0319R9、0319R0)，均采自四川达州，经成都大学药学与生物工程学院刘涛教授鉴定均符合《中国药典》(2015版一部)中的规定，为正品.药材采收时间为2017年8～9月，取全株，去除泥土，洗净，放置于50 ℃条件下干燥，根、茎、叶分别粉碎，过50目筛，避光保存备用.

实验所用试剂包括：溴化钾(批号，20170526)，购自天津卒越化学品有限公司；水为纯化水，其余试剂均为分析纯.

1.2 仪 器

实验所用仪器包括：TU-1810型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，Spectrum Two型傅里叶变换红外光谱仪(美国PerkinElmer公司)，KQ-100E型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)，FA-2004型电子分析天平(上海良平仪器仪表有限公司).

2 方法与结果

2.1 淫羊藿药材不同部位UV指纹图谱的研究

2.1.1 样品的制备.

分别取淫羊藿药材不同部位粉末(根、茎、叶)约0.1 g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入70%乙醇10 mL，超声处理30 min，取出，放冷，再称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，过滤，精密移取续滤液0.5 mL于25 mL容量瓶中，加纯化水定容至刻度，摇匀，制得稀释50倍的供试品溶液.

2.1.2 UV光谱测定条件.

精密移取70%乙醇0.5 mL于25 mL容量瓶中，加纯化水定容至刻度，摇匀，作为空白校零溶液.UV光谱扫描条件为光谱带宽2.00 nm，扫描范围为200～400 nm，光度模式为Abs，扫描间隔1.0 nm.

2.1.3 方法学考察.

1)精密度.按照“2.1.1”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1.2”项下的光谱扫描条件连续扫描6次.选择波峰225、270、318 nm与波谷217、250、301 nm波长处的吸光度值并计算RSD，分别为0.42%、0.48%、0.50%、0.59%、0.52%、0.32%，表明仪器精密度良好.

2)稳定性.按照“2.1.1”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1.2”项下的光谱扫描条件，于供试品制备完后0、1、2、3、4、5 h各扫描1次.选择波峰225、270、318 nm与波谷217、250、301 nm波长处的吸光度值并计算RSD，分别为1.16%、1.07%、1.45%、1.08%、1.17%、0.91%.结果表明，供试品溶液在5 h内稳定性良好.

3)重复性.按照“2.1.1”项下的方法制备供试品溶液6份，按“2.1.2”项下的光谱扫描条件每份扫描1次.选择波峰225、270、318 nm与波谷217、250、301 nm波长处的吸光度值并计算RSD，分别为0.95%、0.94%、0.86%、0.84%、0.85%、0.88%.结果表明，方法重复性良好.

2.1.4 UV图谱采集.

分别取箭叶淫羊藿和柔毛淫羊藿药材样品不同部位(根、茎、叶)粉末各10批，按照“2.1.1”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1.2”项下的光谱扫描条件进行扫描，得10批箭叶淫羊藿和10批柔毛淫羊藿药材样品不同部位(根、茎、叶)的叠加指纹图谱.

2.1.5 UV对照指纹图谱的建立.

将10批箭叶淫羊藿和柔毛淫羊藿药材样品不同部位(根、茎、叶)的吸光度平均值分别做对应的淫羊藿不同部位(根、茎、叶)对照指纹图谱的吸光度，得到相应的UV对照指纹图谱并叠加在一起，其结果如图1所示.由图1可知，药材样品的吸光度整体值大小依次为叶、根、茎.

2.1.6 相似度分析.

对10批淫羊藿药材样品不同部位(根、茎、叶)之间的UV对照指纹图谱进行相似度分析，并经数据处理软件“IBM SPSS statistics”中双变量相关“pearson”分析计算相似度，结果见表1.

图1两种淫羊藿不同部位的UV对照指纹图谱叠加图

表1 淫羊藿样品的UV对照指纹图谱相似度分析

由表1可知，箭叶淫羊藿与柔毛淫羊藿样品的根、茎及叶的UV对照指纹图谱相互之间的相似度均高于0.97.数据说明，药材样品的根、茎、叶的70%乙醇提取液中所含化学物质种类基本相同.

2.2 淫羊藿药材不同部位IR指纹图谱的研究

2.2.1 光谱扫描条件.

将淫羊藿药材样品薄片放入傅里叶变换红外光谱仪中扫描测定.扫描范围4 000～450 cm-1，扫描时扣除H2O和CO2的干扰.

2.2.2 样品溴化钾薄片制备条件.

分别取淫羊藿药材样品不同部位粉末(根、茎、叶)约0.1 g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入70%乙醇10 mL，超声处理30 min，取出，放冷，再称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，过滤，分别取续滤液20、100、200、500 μL，置于洁净玛瑙研钵，挥干，加入溴化钾约0.1 g，研匀，将细粉全部移至压片模具中，于压强为14 MPa的压片机中保持1 min，取出，按照“2.2.1”项下光谱扫描条件扫描，结果如图2.

由图2可知，当所取续滤液为500 μL时，扫描所得图谱中有较多且明显的峰.据此可确定药材样品溴化钾薄片制备方法为：取淫羊藿药材不同部位粉末(根、茎、叶)约0.1 g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入70%乙醇10 mL，超声处理30 min，取出，放冷，再称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液500 μL，置于洁净玛瑙研钵，挥干，加入溴化钾约0.1 g，研匀，将细粉全部移至压片模具中，于压强为14 MPa的压片机中保持1 min，取出，制得样品溴化钾薄片.

图2 4种药材样品溶液的IR图谱

2.2.3 方法学考察.

1)精密度.按照“2.2.2”项下的方法制备药材样品溴化钾薄片，按“2.2.1”项下的光谱扫描条件连续扫描6次.选择图谱中波数为1 510 cm-1、1 305 cm-1、1 261 cm-1、1 220 cm-1、1 179 cm-1、1 075 cm-1处较明显的6个峰，计算各个峰透光率的RSD，分别为0.63%、0.31%、0.26%、0.22%、0.21%、0.07%.结果表明，仪器精密度良好.

2)稳定性.按照“2.2.2”项下的方法制备样品溴化钾薄片，按“2.2.1”项下的光谱扫描条件，于样品溴化钾薄片制备完后0、1、2、3、4、5 h各扫描1次.选择图谱中波数为1 510 cm-1、1 305 cm-1、1 261 cm-1、1 220 cm-1、1 179 cm-1、1 075 cm-1处较明显的6个峰，计算各个峰透光率的RSD，分别为2.57%、2.89%、2.96%、3.25%、3.41%、4.36%.结果表明，样品在5 h内稳定性良好.

3)重复性.按照“2.2.2”项下的方法制备样品溴化钾薄片6份，按“2.2.1”项下的光谱扫描条件每份扫描1次.选择图谱中波数为1 510 cm-1、1 305 cm-1、1 261 cm-1、1 220 cm-1、1 179 cm-1、1 075 cm-1处较明显的6个峰，计算各个峰透光率的RSD，分别为1.75%、1.84%、2.59%、2.23%、2.59%、3.39%.结果表明，方法重复性良好.

2.2.4 IR图谱采集.

取箭叶淫羊藿和柔毛淫羊藿药材样品不同部位(根、茎、叶)粉末各10批，按照“2.2.2”项下的方法制备样品溴化钾薄片，按“2.2.1”项下的光谱扫描条件进行扫描，得10批箭叶淫羊藿和10批柔毛淫羊藿药材样品不同部位(根、茎、叶)的叠加IR指纹图谱.

2.2.5 IR对照指纹图谱的建立.

将10批箭叶淫羊藿和柔毛淫羊藿药材样品不同部位(根、茎、叶)的透光率平均值分别作对应的淫羊藿不同部位(根、茎、叶)IR对照指纹图谱的透光率，得到相应的IR对照指纹图谱，叠加在一起，结果见图3.

图3两种淫羊藿不同部位的IR对照指纹图谱叠加图

2.2.6 相似度分析.

对10批淫羊藿药材样品不同部位(根、茎、叶)之间的IR对照指纹图谱进行相似度分析，并经数据处理软件“IBM SPSS statistics”中双变量相关“pearson”分析计算相似度，结果见表2.

表2 淫羊藿样品的IR对照指纹图谱相似度分析

由表2可知，箭叶淫羊藿和柔毛淫羊藿药材样品的根、茎及叶的IR对照指纹图谱相互之间的相似度大部分高于0.90，最低为0.873.数据表明，药材样品的根、茎、叶的70%乙醇提取液中所含化学物质种类基本相同.

2.2.7 IR对照指纹图谱的峰形分析.

对箭叶淫羊藿和柔毛淫羊藿药材样品不同部位的IR对照指纹图谱进行峰值检出，结果如图4所示.

图4淫羊藿药材样品的IR对照指纹图谱峰值检出

由图4可知，箭叶淫羊藿和柔毛淫羊藿药材样品的根、茎及叶于1 310 cm-1、1 260 cm-1、1 182 cm-1、1 121 cm-1、986 cm-1、945 cm-1、921 cm-1、839 cm-1、815 cm-1波数处均有尖锐吸收峰，叶相比根和茎于1 121 cm-1C-O的伸缩振动有较尖锐吸收峰.数据表明，箭叶淫羊藿和柔毛淫羊藿药材样品的根、茎及叶所含化合物种类基本相同，但苷类、糖类物质有所差别.

3 讨 论

本研究分别对10批箭叶淫羊藿与柔毛淫羊藿药材的根、茎及叶提取物进行了扫描，建立了相应的UV及IR对照指纹图谱.并使用数据处理软件“IBM SPSS statistics”中双变量相关“pearson”分析计算了淫羊藿药材的根、茎及叶对照指纹图谱之间的相似度.研究结果表明，箭叶淫羊藿和柔毛淫羊藿的根、茎及叶的UV及IR对照指纹图谱相互之间的相似度大部分均高于0.90，只有柔毛淫羊藿的叶与茎的IR对照指纹图谱相似度最低，但也高达0.873.此说明，淫羊藿根、茎及叶的70%乙醇提取液中所含化学物质种类基本相同，相关研究表明，不同药用部位某些成分含量有差异，在其加工成饮片后，根、茎与叶质量、体积的差异导致药材容易分层，造成取样不均，从而不利于临床应用及其药效的发挥[7-8].本研究发现，淫羊藿药材的药用部位以叶为最好，同时，还可以将淫羊藿全株进行提取，浓缩，干燥，加辅料做成淫羊藿配方颗粒，再对其含量进行标定，此方法既可解决因其不同部位含量差异造成的临床药用量问题，也可以对原药材进行充分利用，以解决当前中药材原料药短缺的难题.