超声波-酶解辅助提取火龙果皮色素的工艺优化

鲁青，张超凤，严美婷，张良

（江西省食品发酵研究所，江西宜春336000）

火龙果又名红龙果、仙蜜果，典型的热带植物[1]，主要在我国海南、广东、福建和广西等地种植[2]。火龙果果肉和果皮均含有丰富的红色素[3]，红色素的主要成分是甜菜苷类甜菜红素[4]，其安全无害，具有抗氧化作用[5]、抑制脂质氧化[6]和抗肿瘤[7-8]等功效，可作为天然色素添加到食品中。然而在实际生产过程中，由于火龙果皮的不可食用性，因而在加工过程中将其作为废物直接遗弃，浪费资源且增加了环境的压力。若从火龙果皮提取天然色素甜菜红素，不仅原料丰富，增加了火龙果的附加值和企业的经济效益，同时还可缓解环境压力。

目前火龙果色素的提取多采用溶剂浸提法和超声辅助溶剂浸提法，具有成本低、浸提温度低和操作简单等特点[9]。如周俊良等[10]采用的40%乙醇浸提30 min，提取率达7.36%；贺江等[11]采用的超声辅助乙醇溶液浸提20 min，吸光度达0.505。纤维素酶因可提高待提取生物活性成分的提取率[12]的特点经常被用于酶解提取植物活性成分。查找相关文献还未发现利用纤维素酶酶解辅助提取火龙果中的色素。本试验以火龙果皮干粉为原料，超声波-酶解辅助乙醇提取火龙果皮中的色素。采用单因素试验和正交试验优化提取条件，确定最佳的提取工艺并测定该条件下提取制备的色素的色价，以期为火龙果皮中的色素的进一步加工利用提供一定技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

火龙果皮：市售；乙醇（AR）、磷酸氢二钠（AR）：西陇科学股份有限公司；纤维素酶（10万U/g）：和氏璧生物科技有限公司；柠檬酸（AR）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

恒温水浴锅（HHS21-6）：江苏金坛市瑞华仪器有限公司；天平（ML204）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；分光光度计（SP-756PC）：上海光谱仪器有限公司；电热鼓风干燥箱（GZX-9240MBE）：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；高速台式离心机（TGL-15B）：上海安亭科学仪器厂；超低温冷冻储存箱（DWHL340）：中科美菱低温科技有限责任公司；冷冻干燥机（SCIENTZ-10N）：宁波新芝微生物科技有限公司；溶剂过滤器（QL-01）：天津市旗美科技有限公司；直连旋片式真空泵（ZXZ）：浙江临海市永昊真空设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 色素的提取及其制备工艺

火龙果→清洗→皮肉分离→果皮切碎→40℃烘干→粉碎→过筛→提取剂浸提→离心（4 000 r/min，5 min）→收集上清液→真空旋转蒸发浓缩→真空冷冻干燥→粉碎得火龙果色素粉末

1.3.2 操作要点

1）果皮切碎：新鲜果皮清洗后切成1 cm×1 cm的小块，便于后续的干燥和粉碎。

2）烘干：切碎的果皮置于电热鼓风干燥箱中，于40℃烘干12 h。

3）过筛：粉碎后的果皮粉过40目筛，未能过筛的较大果皮颗粒二次粉碎后密封保存，备用。

4）浸提：为防止色素物质发生光分解或光氧化，果皮粉按一定比例溶于提取剂中后，置于黑暗避光环境中浸提。

5）浓缩：上清液浓缩前，将上清液过0.22 μm水系滤膜，抽滤除去色素中的果胶，在40℃条件下，真空旋转蒸发至干，回收乙醇，残渣用少量的蒸馏水溶解得火龙果皮色素浓缩液，备用。

6）真空冷冻干燥：将火龙果皮色素浓缩液在-40℃条件下冷冻24 h，再将其置于提前预冷的真空冷冻干燥器中，干燥24 h。

1.3.3 火龙果皮色素提取工艺优化单因素试验

试验中酶解时间为20 min，浸提料液比为1∶40（g/mL），浸提温度为40℃，pH值为7条件下浸提，每隔10 min搅拌一次，浸提完成后4 000 r/min离心5 min，取上清液待测。以纤维酶（0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%）、乙醇的浓度（0、15%、30%、45%、60%、75%）、超声功率（40、50、60、70、80、100 W）、提取时间（10、20、30、40、50、60 min）为考察因素，以甜菜红素提取率为评价指标，确定最佳的提取工艺参数。

1.3.4 火龙果皮色素提取工艺优化正交试验

在单因素试验的基础上，以甜菜红素提取率为评价指标，以纤维酶添加量、乙醇浓度、超声功率和提取时间考察因素，进行L9（34）正交试验，以确定最佳的发酵工艺，正交试验设计如表1所示。

1.3.5 检验方法

1.3.5.1 甜菜红素含量的测定

利用紫外分光光度计测定火龙果皮色素提取液在波长536 nm的吸光度值，按照以下公式计算提取液中甜菜红素的含量。

甜菜红素的含量（T）=（OD536×550.11）/61 600

式中：OD536为火龙果皮色素提取液在波长536 nm的吸光度值；550.11为标准甜菜红素摩尔分子质量，61 600为标准甜菜红素摩尔消光系数。

1.3.5.2 甜菜红素提取率的计算

甜菜红素得率/%=[（T×V）/m]×100

式中：T为火龙果皮色素提取液中甜菜红素的含量，g/mL；V为提取液的体积，mL；m为火龙果皮粉末的质量，g。

1.3.5.3 色价的测定

色价是指单位质量原料的提取物在1%浓度、以1 cm比色皿在其最大吸收峰处的吸光度。具体的测试方法为：准确称取火龙果皮色素粉m，用pH=3.5柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液溶解并定容，再用缓冲液稀释到合适倍数（溶液的吸光度控制在0.2～0.6之间），在λ=536 nm及1 cm比色血中测定吸光度（A），则产品的色价为：

2 结果与分析

2.1 纤维素酶添加量对甜菜红素提取率的影响

将干燥粉碎的火龙果皮粉末按照工艺流程进行浸提提取，纤维素酶的添加量对甜菜红素提取率的影响见图1。

图1 纤维素酶添加量对甜菜红素提取率的影响Fig.1 Effect of fibrinase addition on extraction rate of betaine

有研究报道纤维素酶增加色素的提取率，但果胶酶不具有这种功能[13]，为此试验中选用纤维素酶联合超声提取技术提取火龙果皮中的色素。由图1可知，当纤维酶添加量为0～0.2%时，随着纤维素酶添加量的增加，甜菜红素提取率随之提高；当纤维酶添加量为0.2%时，甜菜红素提取率达到最高为37.22%；当纤维酶添加量为0.2%～1%时，随着纤维素酶添加量的增加，甜菜红素提取率先下降后趋于平稳，可能是因为底物浓度与纤维素酶量相比过低，使得纤维素酶的效果受到抑制，从而甜菜红素提取率有所降低[12]。为此纤维素酶最佳的添加量为0.2%。

2.2 乙醇的浓度对甜菜红素提取率的影响

乙醇的浓度对甜菜红素提取率的影响见图2。

图2 乙醇的浓度对甜菜红素提取率的影响Fig.2 Effect of alcohol concentration on extraction rate of betaine

由图2可知，当乙醇的浓度为0～30%时，随着乙醇浓度的增加，甜菜红素提取率随之提高；当乙醇的浓度为30%时，甜菜红素提取率达到最大为54.65%；当乙醇的浓度为30%～75%时，随着乙醇浓度的增加，甜菜红素提取率随之下降，原因主要是由于火龙果皮中的甜菜红色素为水溶性，有机浓度过高不利于火龙果皮中色素的提取，可能过高的乙醇浓度还会破坏色素结构，这与高治平等[14]试验结果相一致。为此色素提取的最佳乙醇浓度为30%。

2.3 超声功率对甜菜红素提取率的影响

超声功率对甜菜红素提取率的影响见图3。

图3 超声功率对甜菜红素提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasound power on extraction rate of betaine

由图3可知，当超声功率为40 W～50 W时，随着超声功率的增加，甜菜红素提取率随之提高；当超声功率为50 W时，甜菜红素提取率达到最大为66.3%；当超声功率为50 W～100 W时，随着超声功率的增加，甜菜红素提取率随之下降后趋于平稳，原因主要是由于超声功率的增加会破坏色素结构[15]。为此色素提取的最佳超声功率为50 W。

2.4 提取时间对甜菜红素提取率的影响

提取时间对甜菜红素提取率的影响见图4。

图4 超声时间对甜菜红素提取率的影响Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of betaine

由图4可知，当超声时间为10min～20min时，随着超声时间的增加，甜菜红素提取率随之提高；当超声时间为20 min时，甜菜红素提取率达到最大为70.1%；当超声时间为20 min～60 min时，随着超声时间的增加，甜菜红素提取率随之下降后趋于平稳。为此色素提取的最佳超声时间为20 min。

2.5 正交试验结果与分析

在单因素试验的基础上，考察纤维酶添加量、乙醇浓度、超声功率和提取时间这4个因素对甜菜红素提取率的影响，进行L9（34）正交试验，考虑饮料的适口性，以提取液中甜菜红素提取率为评价指标，确定最佳提取工艺，正交试验结果见表2。

表2 火龙果皮色素提取的正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extractingred pigment of pitaya peel

由表2可知，通过极差分析可知4个因素对甜菜红素提取率的影响大小依次为D＞B＞C＞A，即提取时间对甜菜红素提取率的影响最大，超声功率次之纤维酶添加量影响最小，最佳的提取工艺为A1B2C3D2，在此工艺条件下甜菜红素提取率为68.17%，与正交试验的第二组比较，低于第二组，为此确定甜菜红素提取率最高的工艺为A1B2C2D2，即纤维酶添加量为1%、乙醇浓度为30%、超声功率50 W和提取时间20 min，在此工艺条件下甜菜红素提取率最高为70.15%。

2.6 验证试验

为保证试验的准确性，在A1B2C2D2的工艺条件下进行3次重复试验，甜菜红素提取率分别为69.44%、70.01%、70.73%，均值为70.06%，与正交试验的结果接近，为此正交试验的结果可信。

2.7 火龙果皮色素粉末的制备及其色价的测定

在正交试验确定的最佳提取工艺条件下提取火龙果皮中色素，将上清液过0.22 um水系滤膜，抽滤除去色素中的果胶[16]。在40℃条件下，将除去果胶的上清液真空旋转蒸发至干，残渣用少量的蒸馏水溶解得火龙果皮色素浓缩液，在-40℃条件下冷冻24 h，再将其置于提前预冷的真空冷冻干燥器中，干燥24 h，取出粉碎得火龙果皮色素粉末，测定色价为2.071。

3 结论

本试验以火龙果皮为原料，经鼓风干燥粉碎过筛得火龙果皮粉末。利用超声波-纤维素酶辅助提取火龙果色素。通过单因素试验和正交试验确定最佳火龙果皮色素提取工艺条件为：纤维酶添加量为1%、乙醇浓度为30%、超声功率50 W和提取时间20 min，在此条件下甜菜红素提取率达70.06%，制备的火龙果皮色素粉末的色价为2.071。