异常威克汉姆酵母Y55固定化条件优化及对其酿酒过程的影响

史雁飞,闫凤翔,张泽锟,杜小威,王小勇,张秀红,*

(1.山西师范大学生命科学学院,山西临汾 041004; 2.山西师范大学现代文理学院,山西临汾 041004; 3.山西杏花村汾酒厂股份有限公司,山西汾阳 032205)

清香白酒作为我国历史悠久的酒精饮料之一,以一种特殊的文化方式,在我国传统文化中占据着重要地位。研究发现,适量饮酒可以消除疲劳,增强免疫,加强血液循环等[1]。清香型白酒的主体香气成分是乙酸乙酯和乳酸乙酯,有研究表明乙酸乙酯的合成途径有两种,主要是在酵母醇酰基转移酶作用下,由乙酰辅酶A与乙醇发生转酰基作用而成;另一种是酵母在发酵过程中利用葡萄糖先代谢生成乙醇和乙酸,而后在酵母菌产生的酯化酶作用下使乙酸和乙醇结合生成乙酸乙酯[2]。异常威克汉姆酵母为主的产酯酵母对酒精的耐受性较差,乙醇对异常威克汉姆酵母菌生长和发酵性能具有严重抑制作用[3-5]。稳定产酯酵母的活性,对于增加乙酸乙酯进而改善基酒的品质具有重要的实践意义。

细胞固定化技术是利用物理或化学手段将游离的酵母细胞高浓度限定于固定的载体空间区域内,并不断进行生长繁殖,从而保持活性提高细胞抗逆性并可以反复利用的方法[6-7]。固定化细胞的方法有多种,其中包埋法具有操作简单,对微生物细胞活性影响小等优点,被广泛应用于目前微生物细胞固定化技术中。海藻酸钠作为一种天然高分子多糖,具有无毒害作用,廉价易得等优点,是包埋固定酵母细胞中常用的载体之一。固定化载体对酵母细胞形成保护作用,使具有生长快、反应迅速、可连续使用等优点,越来越广泛的应用于食品发酵工业中[8-10]。

本研究拟以海藻酸钠为固定化载体,氯化钙为辅助剂,在不同条件下固定产酯酵母细胞,探究海藻酸钠浓度等因素对固定化酵母发酵特性的影响,分析固定化酵母于与游离酵母发酵特性的区别,以及加入固定化产酯酵母的固态发酵酿酒的影响,优化产酯酵母细胞的固定化条件。以期为固定化产酯酵母在清香白酒中的实际应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

高粱、大曲 山西省杏花村汾酒厂股份有限公司;异常威克汉姆酵母Y5-5 山西师范大学生命学院生物工程实验室筛选并保藏;酵母膏、蛋白胨、硫酸铜、乙酸钠、酚酞、氢氧化钠、葡萄糖、无水氯化钙、海藻酸钠、盐酸等 均为分析纯,天津市光复精细化工研究所。

PH-3C酸度计 上海雷磁有限公司;XPH-3恒温水浴锅 上海博讯有限公司;电子万用炉 上海恒科实业发展有限公司;SPX-250B-D恒温震荡培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 产酯酵母菌悬液的制备 无菌条件下将酵母菌(W.anomalusY5-5)接种至YPD液体培养基中28 ℃培养至对数期,约12 h,4000 r/min 4 ℃离心10 min,用灭菌的生理盐水稀释成1011、1010、109、108和107个/mL浓度,由血球计数法检测。

1.2.2 固定化酵母细胞的制备 称取海藻酸钠用无菌水加热溶解，配制成一定浓度的海藻酸钠溶液，降至常温。按试验设计取3 mL稀释好的酵母菌悬液与海藻酸钠溶液充分混合均匀，配制成总体积为30 mL，菌液为一定浓度的海藻酸钠酵母菌悬液。无菌条件下用注射器(配有10#注射针头)将上述海藻酸钠酵母菌悬液缓慢滴入相应温度和浓度的氯化钙溶液中造粒，恒温维持1 h，使酵母菌充分固定化。弃去上清液，无菌水冲洗固定化酵母3次后，置于0.05 mol/L氯化钙溶液中24 h后备用[11]。

1.2.3 酵母细胞固定化条件的单因素试验

1.2.3.1 海藻酸钠浓度对固定化酵母细胞发酵的影响 固定化辅助材料氯化钙浓度为2.0 mol/L,固定化温度为20 ℃,包埋菌液浓度为108个/mL,海藻酸钠浓度依次设定为2%、3%、4%、5%、6%,制备固定化酵母颗粒分别加入100 mL YPD液体培养基中,28 ℃发酵7 d后,测发酵液残糖量和颗粒完整率,及串蒸后测样液的总酯和酒精度。

1.2.3.2 氯化钙浓度对固定化酵母细胞发酵的影响 固定化酵母包埋剂海藻酸钠浓度为3%时,固定化温度为20 ℃,包埋菌液浓度为108个/mL,氯化钙浓度分别为0.2、0.8、1.4、2.0、2.6 mol/L 5个梯度,制备固定化酵母颗粒分别加入100 mL YPD液体培养基中,28 ℃发酵7 d后,测发酵液残糖量和颗粒完整率,及串蒸后测样液的总酯和酒精度。

1.2.3.3 固定化温度对固定化酵母细胞发酵的影响 取上述最佳的海藻酸钠浓度3%,氯化钙浓度2.0 mol/L,包埋菌液浓度为108个/mL,分别在10、20、30、40、50 ℃温度水平下固定产酯酵母,将制备的固定化酵母颗粒分别加入100 mL YPD液体培养基中,28 ℃发酵7 d后测残糖量和颗粒完整率,及串蒸测馏出液总酯及酒精度。

1.2.3.4 酵母菌浓度对固定化酵母细胞发酵的影响 设定海藻酸钠浓度为3%,氯化钙浓度2.0 mol/L,固定化温度为20 ℃,包埋固定的产酯酵母浓度分别是106、107、108、109和1010个/mL,将制备的固定化颗粒加入100 mL YPD液体培养基中,28 ℃发酵7 d后测残糖量和颗粒完整率,及串蒸测馏出液总酯及酒精度。

1.2.4 酵母细胞固定化条件正交试验 在单因素试验研究的基础上,选取海藻酸钠浓度、氯化钙浓度、固定温度、菌液浓度为考察因素,进行L9(34)正交试验(表1),以残糖量为指标,来确定最佳固定化条件。

表1 酵母细胞固定化条件正交试验L9(34)因素水平表Table 1 Level table of factors L9(34) for yeast cell immobilization condition orthogonal test

1.2.5 固定化酵母与游离酵母发酵试验比较 取稀释至109个/mL的酵母菌液3 mL制备固定化酵母颗粒,取等体积的游离酵母与固定化酵母颗粒分别置于100 mL YPD液体培养基中,在28 ℃进行发酵7 d后,检测比较发酵液pH、酒精度、总酸、总酯各指标[12-13]。

1.2.6 固定化产酯酵母固态发酵酿酒试验 称取80 g粉碎好的高粱于250 mL发酵装置中,加80 mL水,蒸熟糊化,补加40 mL水,冷却至室温,对照组只加大曲8 g,处理组除了加8 g大曲外,固定化产酯酵母颗粒添加量梯度分别为1%、3%、5%、7%、9%,搅拌均匀,28 ℃封口发酵15 d后,检测酒醅pH、酒精度、总酸、总酯各指标。另一个酿酒试验中同样称取80 g粉碎好的高粱于250 mL发酵装置中,加80 mL水,蒸熟糊化,补加40 mL水,冷却至室温,对照组只加大曲8 g,处理组大曲与固定化酵母添加总量为8 g,比例分别设定为9∶1、7∶3、5∶5、3∶7、1∶9,28 ℃封口发酵15 d,检测酒醅pH、酒精度等指标[14]。

1.2.7 指标测定

1.2.7.1 残糖量的测定 吸取斐林Ⅰ、Ⅱ各5 mL与250 mL三角瓶,加50 mL水摇匀,加热至沸,用2.5 g/L葡萄糖标准溶液滴定,当溶液蓝色即将消失呈红色时,滴加2滴次甲基蓝指示液,继续滴至蓝色消失,记录消耗葡萄糖标准溶液的体积V[15]。

1.2.7.2 酒精度的测定 准确称取50 g酒醅,200 mL蒸馏水加入到蒸馏烧瓶中,充分混匀进行蒸馏,取50 mL酒样于密度瓶中称重计算酒精度[15]。

1.2.7.3 固定化颗粒机械强度的测量 取100粒固定化颗粒,在相同条件下加入50粒玻璃珠,180 r/min震荡4 h后计算颗粒完整率,并以颗粒完整率的大小代表机械强度的高低[13]。

完整率(%)=震荡完成后完整颗粒/100×100

1.2.7.4 总酸和总酯测定 取25 mL酒样于250 mL具塞锥形瓶中,加2滴酚酞,以0.05 mol/L氢氧化钠标准溶液来中和,记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积V。再加25 mL氢氧化钠标准溶液,摇匀,于沸水浴上冷凝回流0.5 h,取下,冷却至室温。用0.1 mol/L盐酸标准溶液进行反滴定,使微红色刚好消失为其终点,记录消耗盐酸标准溶液的体积V1[16]。试样中总酸含量计算公式为:

式中:X:测定总酸的含量(以乙酸计),g/L;C:氢氧化钠浓度,mol/L;V:消耗氢氧化钠的体积,mL;0.0601:与1.0 mol/L氢氧化钠标准溶液1 mL反应,与以克表示的乙酸的质量相当;25:取样体积。

总酯含量计算公式为:

式中:A:测定总酯含量(以乙酸乙酯计),g/L;c:氢氧化钠标准溶液的浓度,mol/L;25.0:皂化回流时加入0.1 mol/L氢氧化钠标准溶液的体积,mL;c1:盐酸标准溶液的浓度,mol/L;V1:反滴定时,消耗0.1 mol/L盐酸标准溶液的体积,mL;0.088:与1.0 mol/L氢氧化钠标准溶液1 mL反应,与以克表示的乙酸乙酯的质量相当;25:样品体积,单位为毫升(mL)。

1.2.7.5 pH的测定 准确称取酒醅5 g,加入45 mL蒸馏水搅拌均匀,封口静置30 min后,6层纱布过滤,测定pH。

1.3 数据处理

试验重复三次,采用SPSS 19.0软件进行正交试验及统计学显著性分析,数据以平均值±标准偏差表示,且p<0.05认为差异显著,并用Excel进行作图。

2 结果与分析

2.1 酵母细胞固定化条件的单因素实验结果

2.1.1 海藻酸钠浓度对固定化酵母细胞发酵的影响 由图1知,海藻酸钠浓度3%时,固定化酵母发酵液的残糖量最低,酒精度和总酯含量最高,而后随着海藻酸钠浓度的增加,发酵液中残糖量逐渐升高,酒精度和总酯量下降,固定化酵母细胞的强度差异较明显。表明海藻酸钠浓度影响着固定化酵母颗粒物质进出,当海藻酸钠浓度较低时,固定化酵母颗粒的空间网状结构大，相对渗透能力增强,有利于底物的进入和产物的排出。但酵母细胞易逸出,固定化酵母颗粒珠易碎裂,起不到固定作用[13]。因此海藻酸钠浓度为3%时,固定化酵母颗粒在发酵特性方面最佳而且机械强度较好。

图1 海藻酸钠浓度对固定化酵母细胞发酵过程的影响Fig.1 Effect of sodium alginate concentration on the fermentation process of immobilized yeast注:图中不同小写字母表示同一指标各组间差异显著，图2～图6同。

2.1.2 氯化钙浓度对固定化酵母细胞发酵的影响 从图2可以看出,随着氯化钙浓度的增大,固定化酵母的机械强度增强,氯化钙浓度为2.0 mol/L的酒精度和总酯含量最高而残糖量最低,但浓度为2.6 mol/L时Ca2+浓度过大,发酵液残糖量有所升高,表明Ca2+浓度可以影响固定化酵母的机械强度,从而影响固定化酵母颗粒通透性。浓度过大时,会使固定化酵母颗粒通透性降低,物质进出速率慢,发酵液中的糖分进入固定化颗粒受阻从而影响发酵。所以氯化钙浓度为2.0 mol/L 时,固定效果最佳。

图2 氯化钙浓度对固定化酵母细胞发酵过程的影响Fig.2 Effect of calcium chloride concentration on the fermentation process of immobilized yeast

2.1.3 固定温度对固定化酵母细胞发酵的影响 从图3可知,随着固定温度的增加,发酵液总酯量及固定化酵母颗粒的机械强度差无显著的变化(p>0.05),在40 ℃发酵液的残糖量为3.82 g/L,与20 ℃时的残糖量有显著差异(p<0.05),而在20 ℃时发酵液酒精度为3.7%(v/v)和其他温度的酒精度有显著差异(p<0.05)。固定化温度为20 ℃时,发酵液的残糖量最低,酒精度和总酯量最高,说明此温度下固定化酵母对营养物质的利用较充分。固定化温度对固定化酵母细胞的发酵影响较小,但考虑到温度在固定化酵母颗粒对发酵液糖浓度的代谢方面的作用,故选取20 ℃为较好的固定温度。

图3 温度对固定化酵母细胞发酵过程的影响Fig.3 Effect of temperature on the fermentation process of immobilized yeast

2.1.4 酵母菌菌液浓度对固定化酵母细胞发酵的影响 由图4知,随着菌液浓度的增加,发酵液酒精度整体呈现先升高后降低的趋势,在固定菌液浓度为108个/mL时,发酵液酒精度和总酯产量最高,残糖量最低,说明此时固定化酵母菌对糖的利用较好,但是与菌液浓度为109个/mL时的总酯产量无显著差异(p>0.05)。而当菌液浓度为1010个/mL时,残糖量有所升高,酒精度和总酯量降低,完整率达到83.7%,所以固定化酵母颗粒的机械强度无明显变化,表明前期酵母菌浓度过大造成其对营养物质的竞争,从而导致后期发酵不足,维持时间不长。因此较佳的酵母菌液浓度为108个/mL。

图4 酵母菌浓度对固定化酵母细胞发酵过程的影响Fig.4 Effect of yeast concentration on the fermentation process of immobilized yeast

2.2 酵母细胞固定化条件优化

据表2可知,以残糖量为固定化酵母对发酵液中糖分物质消耗利用的试验指标,通过极差R值的比较,影响固定化酵母细胞条件的因素依次为A(海藻酸钠浓度)>B(氯化钙浓度)>C(菌液浓度)>D(固定化温度),原因可能与海藻酸钠包埋形成的小球在与磷酸、乳酸等接触后会逐步解体[8],而酵母发酵过程中产生酸类物质有一定的联系,但这为下一步选取海藻酸钠复合固定材料提供依据。据k1、k2、k3的大小可以得出水平最优的组合是A2B2C3D3即海藻酸钠浓度为3%,氯化钙浓度2.0 mol/L,酵母菌液浓度109个/mL,固定化温度25 ℃。

表2 酵母细胞固定化条件优化正交试验结果Table 2 Optimization result of immobilization conditions of yeast cells by orthogonal experiment

2.3 验证实验

正交设计中最优条件为海藻酸钠浓度为3%、氯化钙浓度2.0 mol/L、酵母菌液浓度为109个/mL、固定化温度25 ℃,该优化条件下固定化酵母细胞液体发酵,进行验证,3 次平行实验得残糖量为(2.75±0.03) g/L,验证结果小于表2中的1～9组实验的残糖量,表明此条件下固定化酵母更好地利用糖类物质进行发酵,因此A2B2C3D3可作为最优工艺。

2.4 固定化产酯酵母与游离产酯酵母发酵性能的比较

由表3可知,在最优条件下固定酵母发酵,固定化产酯酵母发酵液pH、总酸、总酯略高于游离产酯酵母,总酸略低于游离产酯酵母。而且pH和总酸含量固定化酵母与游离酵母没有显著性差异(p>0.05),总酯和酒精度差异显著(p<0.05)。表明固定化载体可以对产酯酵母细胞形成保护作用,使得其发酵性能较优。

表3 固定化酵母与游离酵母发酵性能比较Table 3 Comparison of fermentation performance between immobilized yeast and free yeast

2.5 固定化酵母模拟固态发酵酿酒试验

由图5可知,pH、总酸含量较稳定,对照组与处理组没有显著的差异;酒精度处理组较对照组有所提高,添加量为9%时最高,但差异性不显著。总酯含量处理组与对照组差异显著,添加固定化产酯酵母颗粒的处理组总酯含量最高达3.4 g/L,较对照组提高约1倍左右,而处理组之间无显著差异。表明海藻酸钠等固定化材料形成的空间网状结构在发酵后期酒醅乙醇和总酸增加的条件下,可以对产酯酵母有一定程度地保护作用,从而有效的提高酒醅的酯产量。

图5 添加量固定化酵母对酿酒过程的影响Fig.5 Effect of immobilized yeast adding on the brewing process of light-flavor Baijiu

由图6可知,pH、总酸含量、酒精度较稳定,对照组与处理组没有显著的差异;总酯含量处理组与对照组差异显著,添加固定化产酯酵母颗粒的处理组较对照组总酯含量提高约1倍左右,在大曲与固定化酵母添加比为9∶1时总酯含量最高达到了3.38 g/L,而处理组之间无显著差异。综合分析表明,应用固定化酵母颗粒于固态发酵酿酒中,可以在不影响酒醅酒精度,pH等指标的前提下,提高总酯的含量,可以有效的提升白酒的风味物质产量。

图6 大曲与固定化酵母的比例对酿酒过程的影响Fig.6 Effect of the ratio of Daqu and immobilized yeast on the brewing process of light-flavor Baijiu

3 结论

根据单因素及正交试验结果可知海藻酸钠和氯化钙浓度对固定化酵母的机械强度、发酵特性影响较大,固定温度和包埋菌液浓度影响较小。因此产酯酵母细胞最佳的固定化条件为海藻酸钠浓度为3%,氯化钙浓度2.0 mol/L,固定化温度为25 ℃,包埋酵母菌液浓度109个/mL。在该条件下固定化酵母细胞液体发酵,残糖量达到(2.75±0.03) g/L,固定化酵母细胞效果最好。通过固定化酵母与游离酵母发酵性能实验比较,发现固定化酵母细胞相比游离酵母在总酯、酒精度等方面均具有一定的优势,说明固定化载体的网状结构可以对酵母细胞起到保护作用。模拟固态发酵酿酒试验,无论是加入大曲量不变,按比例添加固定化产酯酵母颗粒,还是大曲和固定化酵母以一定比例进行添加,和对照相比酒醅中的酒精度、总酸含量等无显著性变化,而总酯的含量差异明显提高约1倍。说明固定化产酯酵母对于提高清香白酒酒质具有重大意义,为进一步的实践车间生产提供理论依据。