双酶分步酶解提取羊骨中可溶性钙

王雪琦，张珍*，徐红艳，刘倩，李晓叶，郝旭东，赵文宝，周芸

1(甘肃农业大学 食品科学与工程学院，甘肃 兰州，730070) 2(庆阳市食品检验检测中心，甘肃 庆阳，745000)

我国是一个畜牧业大国，每年的畜肉生产和消费总量均处于世界前列，畜禽骨资源极为丰富且价格低廉[1]。羊骨是羊肉加工过程中的副产品，但由于对羊骨相关开发和综合利用方面欠缺，大部分羊骨被丢弃，或者制成附加值较低的饲料，导致其资源化利用比例大大降低[2-3]。钙是人体中所必需且最丰富的无机元素，占总体重的1.5%～2.2%[4]，在骨骼生长、细胞内代谢、血液凝固、神经传导、肌肉收缩和心脏功能中起着重要作用[5-6]。中国的成年人平均每日钙摄入量(RDA)约为800 mg，青少年和老年人每日摄入量为1 200 mg，若钙摄取不足会导致代谢性骨病，如儿童佝偻病和老年人骨质疏松症，更严重会引发骨软化症[7]。

羊骨营养丰富，含有优质蛋白质和最适人体吸收的钙磷盐[8]。其中钙的存在形式主要以磷酸钙构成的羟基磷灰石结晶存在，溶解度很低，若想促进骨钙的利用，必须破坏其羟基磷灰石结晶结构才能得到游离态钙[9]。目前提取骨骼中可溶性钙的方法有酸解、酶解、碱解和微生物发酵等[10]。酸解法可能会破坏蛋白的生物活性；微生物发酵法时间成本过高；碱解法氨基酸受损较为严重[11]。酶解可分解鲜骨中的蛋白质，使骨钙充分游离出来，温度较低，提取时间较短，且对环境的污染也较小[12]。

当前关于酶法提取骨骼中可溶性钙的报道主要集中于单酶提取[13-15]，但是单酶对骨钙的提取效果一般。提高骨钙的溶出，本试验用双酶分步酶解法对羊骨中可溶性钙进行提取，选用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶，采用响应面法分别优化2者的提取条件，接着在各自最优条件下按照不同加入顺序和时间组合分步酶解羊骨粉，制备富含游离钙的羊骨酶解液，旨在提高羊骨的有效利用。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

新鲜羊骨：采自于甘肃省甘南藏族自治州玛曲县欧拉乡的藏绵羊。

木瓜蛋白酶(800 U/mg)、胃蛋白酶(1∶3 000)、氧化镧、HNO3、NaOH、HCl,均购于上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

HH-4A恒温搅拌水浴锅，常州金坛精达仪器制造有限公司；PHS-3C pH计，上海宁隆仪器有限公司；FA2004B分析天平，上海越平科学仪器有限公司；H-1850R型台式高速冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；novAA400P智能火焰-石墨炉原子吸收仪，北京宏昌信科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羊骨粉的制备

参考谭贝妮等[16]的方法，并做适当修改。羊骨先经流水冲洗，剔除大块的碎肉、筋等，再水煮去脂(2 h，95 ℃)，接着高压蒸煮(121 ℃，70 min)，烘干(60 ℃，6 h)，待温度降至室温，粉碎(28 000 r/min)，过筛(60目)，骨粉干燥保存。

1.3.2 羊骨粉的酶解

参考TAN的方法[17]，并做适当调整。准确称取适量羊骨粉样品，加入一定量水(料液比1∶20)，在恒温水浴条件下处理10 min使其完全溶解，调节溶液pH到设定值，按条件加酶(加酶量U/g羊骨粉)，酶解一定时间(酶解过程中保持pH恒定，前1 h，每15 min调1次pH；2 h后，每30 min调1次pH；3 h后，每1 h调1次pH)，反应结束后，沸水浴15 min灭酶活，冷却至室温后，离心取上清液，每个试验重复3次。

1.3.3 酶解单因素试验

参考LOSSO[18]和TIAGO等[19]的方法，并做相应修改。本试验以酶解温度、酶解时间、酶解pH和加酶量为试验因素，每个因素设计5个水平，每个水平重复3次。木瓜蛋白酶、胃蛋白酶的单因素试验水平表为表1。

表1 单因素试验水平表

注：x代表木瓜蛋白酶；X代表胃蛋白酶。下同。

1.3.4 响应面优化试验设计

在木瓜蛋白酶和胃蛋白酶单因素试验的基础上，分别采用Box-Benhnken中心组合设计[20]，以时间(A)、温度(B)、pH(C)和加酶量(D)为影响因素，游离钙含量(R)为响应值设计4因素3水平响应面优化试验，因素水平编码见表2。

表2 响应面试验因素水平表

1.3.5 两种酶分步酶解试验

响应面优化试验下得到的木瓜蛋白酶和胃蛋白酶在各自最优酶解温度、酶解pH和加酶量条件下，将2种酶按酶解的不同顺序和不同时间进行分步酶解试验(表3)。

1.3.6 钙含量的测定

钙含量参照国家标准火焰原子吸收光谱法(GB 5009.92—2016)测定。

表3 分步酶解试验设计表

1.4 数据分析

通过Design-Expert 8.0.6进行响应面试验设计及结果分析，采用IBM SPSS statistics 22.0软件进行统计分析，Origin 8.5软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 酶解温度对游离钙含量的影响

由图1可知，游离钙含量随着对羊骨粉酶解温度的升高，整体趋势呈先上升后下降。当木瓜蛋白酶、胃蛋白酶的酶解温度分别在55、40 ℃时，游离钙含量显著高于其他酶解温度时的含量(P<0.05)，达到最高58.23和806.59 mg/100 g，相比最低含量提高了33.80%、38.55%。再随着温度的继续升高，游离钙含量降低，其原因可能是酶解温度在适宜范围内升高使得反应体系中分子的运动速率加快，酶与底物碰撞的次数也增加，酶解反应进程也加快；但温度过高时，酶分子结构的部分次级键断裂，导致酶一定程度的失活，酶水解效率降低[21]，游离钙含量也降低。所以本试验选取木瓜蛋白酶、胃蛋白酶的酶解温度分别为55和40 ℃作为后续研究参数。

图1 酶解温度对游离钙含量的影响

Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on free calcium content

注：图中小写字母表示组内差异显著(P<0.05)。下同。

2.1.2 加酶量对游离钙含量的影响

由图2可知，游离钙含量随着酶添加量的增加呈先上升后平缓的趋势。当木瓜蛋白酶、胃蛋白酶的加酶量均在5 000 U/g时是曲线的转折点，游离钙含量分别达到54.45和761.41 mg/100 g，相比最低含量提高了58.81%、41.59%，之后再随着加酶量的继续增大，游离钙含量上升不显著。其原因可能是在适宜的加酶量范围内，酶与底物能够充分结合，从而游离钙含量增长较快[22]；当酶过量时，底物逐渐被酶所饱和，超量酶分子就无法和底物进行相互作用，同时酶的活性中心会被其他过量的酶所覆盖，影响酶解效率[23]，游离钙含量增长也变得缓慢，所以本试验选择木瓜蛋白酶、胃蛋白酶的加酶量5 000 U/g作为后续研究参数。

图2 加酶量对游离钙含量的影响

Fig.2 Effect of enzyme dosage on free calcium content

2.1.3 酶解pH对游离钙含量的影响

由图3可知，在一定的pH范围内，游离钙含量是随pH增大呈先增加后降低的趋势。当木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的酶解pH值分别为6和2.5时，游离钙含量显著高于其他酶解pH时的含量(P<0.05)，达到最高61.85和800.26 mg/100 g，相比最低含量提高了38.78%、36.91%。其原因可能是酶对反应体系的pH有一定的敏感性[24]，在pH的作用下，酶分子的空间构象会发生改变，从而会影响酶与蛋白质之间的解离状态[25]，当木瓜蛋白酶、胃蛋白酶的酶解pH分别为6和2.5时，可使更多酶的活性位点外露，增加酶活力，使游离钙含量达到最高。所以本试验选取木瓜蛋白酶、胃蛋白酶的pH值分别为6和2.5作为后续研究参数。

图3 酶解pH对游离钙含量的影响

Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis on free calcium content

2.1.4 酶解时间对游离钙含量的影响

由图4可知，游离钙含量随着酶解时间的不断延长，先上升后趋于平缓。当木瓜蛋白酶、胃蛋白酶的酶解时间均在4 h时，游离钙含量分别达到56.45和898.81 mg/100 g，相比最低含量提高了51.16%、45.48%。再随着酶解时间的继续延长，游离钙含量增长趋于平缓，其原因可能是在酶解初期，酶活性位点较多，使得酶解效率上升趋势明显，而随着反应时间不断延长，暴露的酶活性位点相对较少且大多数底物已经被酶解，使反应速率逐渐下降，反应强度减弱[26]；从生产效率来看，时间的延长会使生产效率降低[27]。所以本试验选取木瓜蛋白酶、胃蛋白酶最适酶解4 h作为后续研究参数。

图4 酶解时间对游离钙含量的影响

Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on free calcium content

2.2 酶解工艺响应面优化

2.2.1 木瓜蛋白酶响应面优化

在木瓜蛋白酶单因素试验的基础上，利用Design-Expert 8.0设计软件，采用Box-Behnken中心组合试验设计方案及结果见表4。

表4 木瓜蛋白酶响应面设计及结果表

以酶解时间、酶解温度、酶解pH值和加酶量对酶解工艺参数进行优化，获得二次回归方程为：R=76.25-0.23A-1.37B+4.36C+0.74D+6.27AB-3.90AC-2.72AD-0.20BC+4.54BD-1.25CD-17.68A2-25.80B2-23.07C2-18.92D2。同时，对模型进行方差分析的显著性检验，见表5。

表5 木瓜蛋白酶二次回归方程模型方差分析表

注：**表示该指标极显著P<0.01；*表示该指标显著0.01

F值越大，响应曲面越陡，说明2种因素之间的相互作用越明显[28-29]。方差分析表可以看出交互项AB差异性达到极显著水平(P<0.01)，交互项AC、BD达到显著水平(P<0.05)，交互项AD、BC、CD影响均不显著(P>0.05)，二次项A2、B2、C2、D2的P值均小于0.000 1，说明4个因素对游离钙含量具有显著的二次效应，各因素对游离钙含量的影响大小顺序为：酶解pH>酶解温度>加酶量>酶解时间，并且各考察因素对游离钙含量影响具有交互作用，并不是简单的线性关系，因此，可用此回归方程试验结果进行分析及预测。

此模型得到的木瓜蛋白酶提取羊骨中可溶性钙的最优工艺参数为：酶解温度54.86 ℃、酶解时间3.98 h、酶解pH 6.05、加酶量5 015.03 U/g，其游离钙含量达到76.49 mg/100 g。验证试验时，考虑到操作的可行性，将最优工艺参数调整为酶解温度55 ℃、酶解时间4 h、酶解pH 6.0、加酶量5 000 U/g，此酶解条件在响应面设计方案中已涉及，得到的游离钙含量最高是79.02 mg/100 g，与理论值基本相符。

2.2.2 胃蛋白酶响应面优化

综合胃蛋白酶单因素试验结果，以酶解时间、酶解温度、酶解pH值和加酶量为考察因素，采用Box-Behnken中心组合试验设计方案结果见表6。

根据Design-Expert 8.0软件进行多元回归拟合后，获得二次回归方程为：R=1 004.58+20.21A+20.70B+29.19C+48.58D+14.48AB-83.47AC-20.54AD-2.92BC+96.77BD-46.92CD-125.51A2-282.06B2-251.13C2-150.63D2。同时，对模型进行方差分析的显著性检验，结果见表7。

表6 胃蛋白酶响应面设计及结果表

表7 胃蛋白酶二次回归方程模型方差分析表

此模型得到的胃蛋白酶提取羊骨中可溶性钙的最优工艺参数为：酶解温度40.34 ℃、酶解时间4.06 h、酶解pH 2.52、加酶量5 348.28 U/g，其游离钙含量达到1 010.58 mg/100 g。验证试验时，考虑到操作的可行性，将最优工艺参数调整为酶解温度40 ℃、酶解时间4 h、酶解pH 2.5、加酶量5 300 U/g，平行3次，得到的游离钙含量是1 008.68 mg/100 g，与理论值基本相符。

2.3 2种酶分步酶解试验结果

图5中，木瓜蛋白酶和胃蛋白酶在不同酶解顺序下，对比4种不同酶解时间组合(1 h+1 h、2 h+2 h、3 h+3 h和4 h+4 h)，可看出时间组合(3 h+3 h)时所得的游离钙含量是最多的，极显著高于1 h+1 h、2 h+2 h、4 h+4 h时间组合(P<0.01)；同时先木瓜蛋白酶后胃蛋白酶酶解羊骨粉所得游离钙含量在任何1种时间组合中都显著高于先胃蛋白酶后木瓜蛋白酶(P<0.01)。所以本试验的最优酶解组合为：在2种酶各自最优酶解温度、酶解pH、加酶量条件下，先木瓜蛋白酶酶解3 h，后胃蛋白酶继续酶解3 h，最终得到的游离钙含量最高，可达到1 839.14 mg/100 g，相比1 h+1 h、2 h+2 h和4 h+4 h时间组合酶解分别提高了62.30%、35.98%、17.81%。

图5 不同酶解顺序和时间组合对游离钙含量的影响

Fig.5 Effects of different enzymatic hydrolysis sequences and time combinations on free Calcium content

注：图中大写字母表示组间差异极显著(P<0.01)；小写字母表示组内差异极显著(P<0.01)。

3 结论

通过单因素试验和响应面优化结果，确定了木瓜蛋白酶和胃蛋白酶分别提取羊骨中可溶性钙的最佳工艺条件：酶解温度55、40 ℃、酶解时间均为4 h、酶解pH 6.0、2.5，加酶量5 000、5 300 U/g，所测实际游离钙含量是79.02 mg/100 g和1 008.68 mg/100 g；在2种酶各自最优条件下按不同加入顺序和不同时间组合酶解羊骨粉，确定最优条件为先加木瓜蛋白酶酶解3 h，后加胃蛋白酶酶解3 h，酶解液游离钙含量达到最高1 839.14 mg/100 g；双酶分步酶解羊骨粉得到的游离钙含量极显著高于单一添加酶(P<0.01)，相比木瓜蛋白酶和胃蛋白酶分别提高了95.70%和45.15%，为羊骨可溶性钙的提取提供了理论基础。