不同干燥方式泽泻汤指纹图谱的建立及2 种成分测定

伍蕊嗣， 姚运秀， 刘 钱， 杨 慧， 曾琦璐， 刘 涛*

（1. 成都大学药学与生物工程学院， 四川 成都610106； 2. 四川省中医药科学院， 四川 成都610041； 3.广西中医药大学药学院， 广西 南宁530001）

中药经典名方泽泻汤出自东汉张仲景《金匮要略·痰饮咳嗽病》篇, 原文记载为“心下有支饮, 其人苦冒眩, 泽泻汤主之” “泽泻五两, 白术二两, 右二味, 以水二升, 煮取一升, 分温再服”。 泽泻汤由泽泻和白术2 味药组成, 具有消饮利水、 调补脾肾之功效, 系历代医家治疗痰饮所致眩晕之效方。 目前广泛应用于临床, 疗效显著, 现代多用于治疗梅尼埃病、 良性阵发性位置性眩晕、椎基底动脉供血不足等眩晕病[1]。

古代经典名方制剂的研制分标准煎液与制剂研制2 个阶段, 标准煎液应作为经典名方制剂药用物质确定的基准[2]。 干燥是其制备工艺中必不可少的步骤, 减压、 常压、 喷雾、 冷冻干燥是中药提取物常见的干燥方式, 由于原理及加热方式不同, 不同的干燥方式可能会对产物的成分含有量及物理性质产生影响[3-4]。

目前干燥方式对药物的影响多以指标成分含有量作为评价依据, 不能全面地反应对物料的影响,不同干燥方式会对产物的粉体学性质产生影响, 进而关系到制剂工艺过程及质量, 最终影响制剂安全性、 稳定性及有效性。 然而这方面的研究却不多[5], 未查见关于经典名方标准煎液干燥方式的研究报告, HPLC 指纹图谱是中药整体质量评价思路的重要体现, 这一技术已广泛应用于中药质量评价[6]。 HPLC 波长切换指纹图谱能反映样品更多的化学信息, 色谱峰分离效果更好, 数量更多, 峰型更美观, 以达到更好的整体质量控制目的[7-8]。

为了更全面地研究不同干燥方式对泽汤标准煎液的物理及化学性质的影响[9], 本研究通过建立HPLC 指纹图谱、 物理指纹谱及成分含有量测定,考察4 种干燥方式对经典名方泽泻汤标准煎液的影响, 以期为泽泻汤制剂的研发提供参考。

1 仪器与材料

SQP Satorious 型电子天平[赛多利斯科学仪器（北京） 公司]； BS-6KH 型电子天平（上海友声衡器公司）； FA2004 型电子分析天平（上海良平仪器仪表公司）； 3～9 号药典筛（道墟化验仪器厂）；DSH-10 A 型电子水分测定仪（邦西仪器科技公司）； HS-3120 型超声波清洗器（天津市恒奥科技公司）； TD5 型台式多管架离心机（长沙英泰仪器公司）； TU-1810 型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器公司）； P230Ⅱ型高效液相色谱仪（大连依利特分析仪器公司）； Waters 2695 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）。

泽泻饮片（批号20180301）、 白术饮片（批号20180301） 均购自四川省成都市金牛区荷花池中药材市场, 经成都大学刘涛高级工程师鉴定分别为正品。 23-乙酰泽泻醇B 对照品（wkq16040904）、白术内酯Ⅲ对照品 （wkq16092604）, 含有量≥98%, 均购于四川省维克奇生物科技公司； 氯化钠（2017081101, 成都市科龙化工试剂厂）。

2 方法与结果

2.1 泽泻汤标准煎液制备 在单因素试验的基础上, 利用星点设计-效应面法确定了泽泻汤标准煎液的提取工艺, 以白术内酯Ⅲ转移率为指标确定了其浓缩工艺, 即取泽泻和白术饮片（5 ∶2） 适量,加13.41 倍水回流提取, 提取3 次, 2.21 h/次,趁热过滤, 取滤液进行减压浓缩（80 ℃, -0.08 ～-0.09 MPa） 至密度为1.05～1.10 （80 ℃）。

经前期4 种干燥方式工艺参数优选后, 将同一批浸膏等分为4 份, 分别进行常压干燥（80 ℃）、减 压 干 燥 （80 ℃, - 0.08 MPa）、 冷 冻 干 燥（t预冻= 2 h, - 55 ℃, P ＜10 Pa）、 喷 雾 干 燥（T进风=150 ℃, T出风=60 ℃）, 所得干膏含水量分别为4.48%、 4.19%、 4.04%、 4.54%, 将所得干膏经相同粉碎时间后过2 号筛, 即得。

2.2 物理指纹图谱[10-14]

2.2.1 物理属性确定 共筛选出9 个物理参数,分别为相对均齐指数（Iθ） 是指粉末粒径的分布均匀程度； 松密度（Da） 表示粉末的工艺性能, 是指粉末在规定条件下自由充满标准容器后所测得的堆积密度； 振实密度（Dc） 是指粉末在规定条件下经振实所测得的单位容积的质量； 豪斯纳比（IH） 表示粉末的流动性, 数值越接近于1, 则流动性越好； 休止角（α） 是衡量粉末流动性的重要参数, α＜30°时流动性好, α＞45°时流动性差； 卡尔指数（IC） 表示粉末能够被震实的能力； 颗粒间孔隙率（Ie） 表示粉末的可压性； 吸湿性（H）表征粉末的稳定性, 是指物质在一定环境条件下吸附水分的能力； 干燥失重（HR） 是指物料中水分及挥发性成分含有量, 其高低不仅对物料成分含有量有影响, 还可能导致物料变质, 是1 个重要的物理参数。

以上9 个参数, 为物理指纹谱的二级指标。 根据泽泻汤标准煎液物理性质, 将其粉体学质量属性分为5 个物理指纹谱一级指标, 即稳定性、 均一性、 流动性、 堆积性和可压性。 以吸湿性和干燥失重表征稳定性； 以相对均齐指数表征均一性； 以豪斯纳比及休止角表征流动性, 良好的流动性可保证固体制剂的成型工艺和产品质量； 以振实密度和松密度表征堆积性； 以卡尔指数和颗粒间孔隙率表征可压性。

2.2.2 测定方法 物理指纹谱二级指标的测定首选法定标准收载方法。 松密度, 取洁净、 干燥的50 mL 量筒, 将20 g 左右待测粉末缓慢地加入到量筒中, 轻轻抹平粉末表面, 读取待测粉末的体积；振实密度, 将上述盛有待测粉末的量筒, 同一高度上下振动200 次, 读取待测粉末的体积； 相对均齐度指数, 将待测粉末依次过药典筛3 ～9 号筛, 振荡5 min, 分别记录每个筛网上截留的粉末质量。取平均孔径分别为0.302 5、 0.215 0、 0.165 0、0.137 5、 0.107 5、 0.082 5 mm 的筛网截留的粉末, 计算相对均齐度指数, 公式为Iθ=Fm/100+（dm-dm-1） Fm-1+ （dm+1-dm） Fm+1+ （dm-dm-2）Fm-2+ （dm+2-dm） Fm+2…（dm+n-dm） Fm+n, 其中, Fm为中间粒径范围粉末的质量百分比, Fm-1为中间粒径范围下一层粉末的质量百分比, Fm+1为中间粒径范围上一层粉末的质量百分比, n 为所确定的粒径范围个数, dm为中间粒径范围的粉末平均粒径,dm-1为中间粒径范围下一层的粉末平均粒径, dm+1为中间粒径范围上一层的粉末平均粒径； 豪斯纳比, 由松密度和振实密度计算而得, 公式为IH=Dc/Da； 休止角, 采用固定漏斗法测定, 将2 个漏斗串联放置漏斗下端顶尖位置距离坐标纸的高度为H, 缓慢匀速地将粉末倒入漏斗中, 直至粉末所形成圆锥体的顶尖接触到漏斗的顶尖位置时, 计算圆锥体底面半径R, 公式为α=tan-1（H/R）； 颗粒间空隙率, 由松密度和振实密度计算而得, 公式为Ie= （Dc-Da） / （Da×Dc）； 卡尔指数, 由松密度和振实密度计算而得, 公式为IC= （Dc-Da） ×100/Dc； 干燥失重, 使用快速水分测定仪, 取约3 g待测粉末平铺于样品盘中, 于105 ℃下加热10 min, 根据仪器显示的最终读数记录即可； 吸湿性为取干燥的蒸发皿置于下部盛有饱和氯化钠水溶液的恒温干燥器中, 12 h 后精密称定质量（m1）。取约3 g 待测粉末平铺于上述蒸发皿中, 精密称定质量（m2）。 将蒸发皿置于上述恒温干燥器中,24 h后精密称定质量（m3）。 计算其吸湿性, 公式为H= （m3-m2） / （m2-m1）。

2.2.3 物理参数标准化转换 由于二级物理质量指标的数值和量纲不同, 为了方便在同一雷达图更加直观的表现出来, 参照药典标准和相关文献资料, 确定每个指标的可能数据范围, 然后将其所测的物理参数数值标准化至0～10, 见表1。

表1 物理质量指标的可接受范围及标准化转换公式Tab.1 Limit values accepted for the physical quality indexes and standardized conversion formula

2.2.4 物理指纹谱建立 取经4 种干燥方式所得的3 批泽泻汤标准煎液, 按“2.2.2” 项下方法测定并按表1 标准化转换物理参数, 构成不规则的九边形叠加物理指纹谱, 结果见图1。

2.2.5 相似度分析 以减压干燥为基准, 采用SPSS 数据处理软件中Pearson 法对4 种干燥方式所得3 批泽泻汤标准煎液物理指纹谱进行相似度分析, 比较不同干燥方式所得泽泻汤标准煎液的物理性质差异, 结果见表2。

表2 物理指纹谱相似度Tab.2 Similarities of physical fingerprints

图1 各样品物理指纹谱Fig.1 Physical fingerprints of various samples

其余3 种干燥方式与减压干燥方式所得物理指纹谱相似度均值的RSD 54.99%, 结果表明, 不同干燥方式对泽泻汤标准煎液物理指纹谱有较大影响。

2.3 HPLC 指纹图谱

2.3.1 供试品溶液制备 精密称定干膏粉末1 g于100 mL 锥形瓶中, 精密移取10 mL 甲醇作为溶剂, 称定质量, 超声40 min, 冷却至室温后, 称定质量, 补足溶剂, 混匀后过0.45 μm 有机滤膜即得。

2.3.2 色谱条件[15]依利特Supersil C18色谱柱（4.6 mm× 250 mm, 5 μm）； 柱温35 ℃； 流动相乙腈 （A） -水 （B）, 梯度洗脱 （0 ～30 min,10% ～45% A； 30 ～85 min, 45% ～90% A； 85 ～90 min, 90% ～10% A； 90 ～100 min, 10% A）； 体积流量1 mL/min； 检测波长（0 ～50 min, 240 nm；30～85 min, 240 ～210 nm； 85 ～90 min, 210 nm）；进样量10 μL。

2.3.3 方法学考察（减压干燥样品）

2.3.3.1 精密度试验 按“2.3.1” 项下方法制备供试品溶液, 在“2.3.2” 项色谱条件下, 连续进样6 次, 测得各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD 分别在2.54%和0.63% 内, 表明仪器精密度良好。

2.3.3.2 稳定性试验 按“2.3.1” 项下方法制备供试品溶液, 在“2.3.2” 项色谱条件下, 于配制后0、 2、 4、 6、 8、 10 h 连续进样6 次, 测得各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD 分别在1.71%和0.46%内, 表明供试品溶液在10 h 内稳定性良好。

2.3.3.3 重复性试验 按“2.3.1” 项下方法制备供试品溶液6 份, 在“2.3.2” 项色谱条件下进样, 测得各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD 分别在1.74% 和0.43% 内, 表明该方法重复性良好。

2.3.3.4 HPLC 指纹图谱建立 取3 批经4 种干燥方式所得泽泻汤标准煎液, 按“2.3.1” 项下方法制备供试品溶液, 在“2.3.2” 项色谱条件下进样, 得不同干燥方式泽泻汤标准煎液的HPLC 叠加指纹图谱, 结果见图2。

图2 12 批样品HPLC 指纹图谱Fig.2 HPLC fingerprints of twelve batches of samples

2.3.3.5 相似度分析 以减压干燥为基准, 采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A 版软件对4 种干燥方式所得3 批泽泻汤标准煎液HPLC 指纹图谱进行相似度分析, 结果见表3。

表3 12 批样品相似度Tab.3 Similarities of twelve batches of samples

其余3 种干燥方式与减压干燥方式所得HPLC指纹图谱相似度均值RSD 6.54%, 表明, 不同干燥方式对泽泻汤标准煎液HPLC 指纹图谱有一定影响。

2.4 样品含有量测定

2.4.1 色谱条件[16-17]依利特Supersil C18色谱柱（4.6 mm× 250 mm, 5 μm）； 柱温35 ℃； 流动相乙腈（A） -水（B）； 体积流量1 mL/min； 检测波长白术内酯Ⅲ220 nm, 23-乙酰泽泻醇B 208 nm；进样量10 μL。

2.4.2 样品含有量 按“2.3.1” 项下方法制备供试品溶液, 在“2.4.1” 项色谱条件下进样, 以干燥品计算23-乙酰泽泻醇B 和白术内酯Ⅲ的含有量, 结果见表4。

表4 不同干燥方式各成分含有量测定结果（μg/g）Tab.4 Results of content determination of various constituents in different drying methods （μg/g）

4 种干燥方式23-乙酰泽泻醇B 含有量均值的RSD 25.48%, 含有量排序为冷冻干燥＞减压干燥＞常压干燥＞喷雾干燥； 白术内酯Ⅲ含有量均值的RSD 25.89%, 含有量排序为冷冻干燥＞减压干燥＞常压干燥＞喷雾干燥, 表明不同干燥方式所得泽泻汤标准煎液成分含有量有一定差别, 且减压干燥与常压干燥对以上2 种成分含有量的影响差距不大,最终优选冷冻干燥。

3 讨论

标准煎液作为经典名方制剂药用物质确定的基准, 在古代经典名方制剂的研制中占有极其重要的地位, 经典名方制剂的质量标准必须依据标准煎液进行制定。 而如何建立能反应理化属性的指标成为其质量标准研究的关键[18]。

对中药整体质量进行控制是对中药质量评价的重要途径, 采用指纹图谱对其进行宏观综合分析是1 种有效的手段, 主要有液相、 气相、 质谱、 紫外、 红外光谱法等[5]。 目前, HPLC 一般是在单一波长下对出峰物质进行控制, 泽泻汤标准煎液在单一波长下出峰不多, 无法反映其更多的化学信息,本研究采用了波长切换的方法, 采集不同保留时间及不同吸收波长下更多的物质信息, 达到了更好的整体质量控制目的。 不同的物料有不同的物理性质, 本研究建立的物理指纹图谱包含9 个二级指标去反应物料的吸湿性、 流动性及均一性等, 亦可为整体质量控制方式。

本研究以减压干燥方式所得到的物料为基准,与其余3 种干燥方式所得物料的HPLC 和物理指纹谱的相似度、 白术内酯Ⅲ及23-乙酰泽泻醇B 含有量测定结果的RSD 值指为指标, 通过其大小来判断不同干燥方式对泽汤汤标准煎液理化性质的影响, 方法简单可行。 结果表明不同干燥方式对泽泻汤标准煎液粉末可压性影响较大； 对HPLC 指纹图谱中色谱峰3 （未知共有峰） 和色谱峰11 （未知共有峰） 及23-乙酰泽泻醇B 和白术内酯Ⅲ的含有量有一定的影响。 综合考虑, 4 种干燥方式中, 冷冻干燥为泽泻汤标准煎液的最佳干燥方式。