视网膜动脉与脑动脉粥样硬化相关性的实验研究

杨蕤郡 王海丽 李瑞萍 张俊士 邓锦波△

1)河南省人口和计划生育科学技术研究院，河南 郑州 450002 2)河南大学淮河医院神经内科，河南 开封 475000

脑动脉粥样硬化症是中老年人的一种常见病、多发病，是造成脑卒中的直接病因之一，致残、致死率极高，对老年人的身体健康造成极大危害[1-3]。最新调查显示[4]，脑血管疾病已成为威胁人类生命的重要疾病，同时也是除恶性肿瘤外威胁国民生命安全最危险的“杀手”，位居城镇居民死亡原因的第1位。目前，多通过颅内磁共振血管成像、血管造影等大型检查，结合彩色多普勒超声以及实验室检查等手段对脑动脉粥样硬化作出诊断，但这些检查手段有的对人体伤害较大，有的费用高，有的手续繁琐[5-12]，给患者带来诸多不便。因此，找出一种快速、简便、廉价、高效的诊断方法尤为重要。本研究通过动物实验结合临床资料的分析，对眼底动脉硬化与脑动脉硬化之间的关系进行研究，以期通过检查患者眼底动脉状况评估和诊断脑动脉硬化，从而降低检查成本，实现快速、高效、无损伤的诊断。目前，国内已有团队对临床上脑动脉粥样硬化与视网膜动脉硬化间的关系进行研究[13-15]，但缺乏临床资料与基础研究的支撑。本研究通过对小鼠视网膜动脉的观察，结合临床数据的整理分析，对视网膜动脉硬化与脑动脉硬化之间的相关性做进一步的探讨。

1 材料和方法

1．1实验动物河南省实验动物中心提供用于繁殖的雌雄昆明小鼠(合格证号：SCXK豫2010-0002)，将其饲养在室温22～25 ℃、相对湿度60%～70%的状况下。定期消毒，房间面积20 m2。按自然昼夜节律采光、自由进食和饮水。成年健康雌雄鼠于18：00时以2∶1合笼，次日08：00前查栓，以观察雌鼠阴道栓塞之日计为受孕当日，也称E0(embryonal day 0，E0)；仔鼠诞生当日计为P0(postnatal day 0，P0)。新生小鼠饲养至成年(P90)新生小鼠饲养至成年(P90)及老年(约P360)，成年小鼠12只，老龄小鼠13只，共25只。

1．2免疫组织化学染色用10%水合氯醛(1～1.5 mL/kg体质量)腹腔注射麻醉后，先用37 ℃生理盐水经左心室灌流，后用4%多聚甲醛经左心室进行灌流，取下眼球，剪去与眼球相连的视神经，体式显微镜下分离出视网膜，制备不同年龄的视网膜铺片。视网膜铺片经0.01 mol/L PBS(pH=7.4)漂洗3次，每次5 min，放入4% PFA 4 ℃固定2～3 h，然后PBS漂洗3次，每次15 min，用一抗4 ℃孵育过夜，一抗为兔抗鼠Ⅳ型胶原蛋白(血管基底膜标记物，Collagen Ⅳ，1∶600，Abcam，ab6586)。0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次15 min。二抗为Alex/Fluro568标记羊抗兔IgG(1∶600，Invitrogen，A10042)，4 ℃孵育过夜。0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次15 min。洗好后将视网膜剪成“十”字花型，将视网膜神经节细胞层向上平铺在干净的载玻片上，滴加封片剂，加盖盖玻片，指甲油封固四周，晾干后在荧光显微镜下(BX61，Olympus)观察拍片。

1．3明胶墨汁灌流显示小鼠视网膜上的血管网用10%水合氯醛(1～1.5 mL/kg体质量)腹腔注射麻醉后，先用37 ℃生理盐水经左心室灌流，后用4%多聚甲醛经左心室进行灌流，再用约37 ℃生理盐水灌流至流出的液体变清，再用60 ℃的6.5%明胶墨汁灌流至全身变黑，然后在小鼠心脏根部结扎，放入—20 ℃冰盒中冷冻2 h左右。取下眼球，剥离视网膜，剪成“十”字花型，平铺在干净的载玻片上，用0.01 mol/L PBS封片，指甲油封固四周，晾干后在显微镜下观察视网膜各层血管以及血管半径变化并拍片。

1．4临床资料收集研究对象选取2017-05—10在河南大学淮河医院神经内科及老年病学科就诊的患者。采取检查结果和问卷调查相结合的方法，收集对照组和视网膜动脉硬化组患者的眼底镜、头部磁共振血管成像检查及生化资料。所有研究对象由眼科及神经内科专科医生根据病史、临床症状和辅助检查结果进行严格筛选和诊断。按诊断结果分为视网膜动脉硬化组和对照组。脑血管检查主要包括头部磁共振血管成像(MRA)、颈部血管彩超、血液生化检查等。眼科检查包括视力、眼压、裂隙灯、眼底镜检查(12500-DY型眼底镜)等。根据纳入标准和排除标准，最终22例进入资料分析统计。纳入标准：(1)对本实验知情的前提下自愿加入者；(2)能积极配合各项检查，可在小瞳下观察视网膜血管者。排除其他非动脉粥样硬化导致的视网膜病变。

1．5数据测量与统计学处理

1．5．2 临床数据处理：根据收集到的数据采用Excel软件建立数据库，录入对照组和动脉硬化组成员各项参数，如血脂、血糖、C反应蛋白等血液生化检查结果，颈动脉彩超，尤其是视网膜以及脑动脉硬化检查结果的各种数据。采取t检验、χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1视网膜血管老化观察由抗体Collagen Ⅳ标记的视网膜血管网，发现成年小鼠与老龄鼠视网膜血管不同(图1)。成年小鼠的视网膜血管网密集，血管之间的吻合支较多，血管分支较多，血管管径较大(图1A)。老龄鼠的视网膜血管较稀少，血管之间的吻合支较少，血管分支减少，管径变细(图1E)。高倍镜观察视网膜动脉，发现成年小鼠的无细胞毛细血管数较多(图1C)，老龄鼠的无细胞毛细血管数较少(图1B)。随着小鼠发生老化，小鼠血管网密度下降，血管体密度减少(图2)。墨汁灌流结果与抗体Collagen Ⅳ标记的小鼠视网膜血管网发育情况一致(图1D、F)。

图1 成年小鼠和老龄小鼠视网膜血管网比较 A～D：荧光显微镜下小鼠血管比较；A、C：低倍镜下成年小鼠和老龄小鼠视网膜血管网的大体比较；A：在小鼠刚成年时视网膜血管分支较多，血管网密集，血管较粗；C：随着小鼠年龄的增长，老龄小鼠的视网膜血管减少，分支也逐渐减少，血管网较为稀疏管径较细，靠近视乳头部分血管分支减少；B、D：显示高倍镜下小鼠视网膜血管网的局部发育情况；B：成年小鼠视网膜血管吻合分支较多，且无细胞毛细血管数(→)分布密集；D：老龄小鼠分支明显减少，无细胞毛细血管(→)稀疏；E、F：光学显微镜下小鼠血管比较；E：成年小鼠血管分支较多，走形平缓；F：老年小鼠分支减少，走形僵硬，弯曲度增加；A～D：视网膜血管网标记由抗体Collagen Ⅳ标记(红色)；E、F：视网膜血管网通过墨汁灌流显示。A、C：标尺=100 μm；B～F：标尺=50 μmFigure 1 The comparison of retinal vascular networks in adult mice and aged mice A-D：The retinal vascular networks in mice under fluorescence microscope (Collagen Ⅳ fluorescent labeling)；A，C：General comparison of retinal vascular networks in adult mice and aged mice at low magnification；A：The adult mice have larger diameter retinal blood vessel caliber，multiple vascular branches and dense network of vessels；C：The number of retinal vascular，vascular branches and the density of vasculosum are all decreased with the age increase of the adult mice；B，D：The local development of retinal vascular network in mice with high magnification；B：The adult mice have abundant microvascular anastomosis and thick acellular capillaries (→)；D：The reduction of microvascular anastomosis and acellular capillaries(→) is obviously in aged mice；E，F：The retinal vascular networks of mice under light microscope (Gelatin-ink perfusion)；E：The adult mice have numerous branches of vessels which run gently；F：The aged mice have fewer branches of vessels whose courses are stiff and contorted．A，C：Bar=100 μm；B-F：Bar=50 μm

2．2临床资料

2．2．1 视网膜动脉硬化：眼底镜下，正常组视网膜血管分布均匀，粗细适中，折光性不强(图3A)。视网膜动脉硬化患者的视网膜发生改变，可分为4个级别[16]。Ⅰ级视网膜血管硬化：未见明显的小动、小静脉交叉处的压迫征，但可以发现眼底小动脉管径大小不均、管径变细、动脉反光带加宽；Ⅱ级视网膜血管硬化：小静脉两端变细或出现“S”样、“Z”样移位，同时伴随反光带增宽且呈铜丝样外观；Ⅲ级视网膜血管硬化：动静脉交叉处典型压迫症普遍存在，伴视网膜片状出血、棉绒斑和水肿，眼底小动脉外观呈铜丝样(图4A)；Ⅳ级视网膜血管硬化：眼底小动脉呈呈银丝状，严重动静脉交叉压迫症较为广泛，并出现视乳头水肿。

2．2．2 脑动脉粥样硬化观察：视网膜动脉硬化组患者有以下病变：①头部磁共振血管成像显示，颅内动脉管壁走形僵硬，管腔变窄，动脉显影略细，动脉分支走行异常(图3B、4B)；②颈部血管彩色多普勒超声检查显示，动脉硬化患者的血管内膜粗糙，血管壁内-中膜厚度(intima-media thickness，IMT)增加，回声不均匀，且探及到动脉硬化斑块产生，血管出现狭窄(图3C、4C)。

2．2．3 脑动脉粥样硬化与视网膜动脉硬化的关系：对照组8例中7例未发生脑动脉粥样硬化，1例出现脑动脉粥样硬化表现。视网膜动脉硬化组14例均出现不同程度的脑动脉粥样硬化。眼底动脉硬化患者均发生脑动脉硬化(P<0.01)。眼底动脉硬化程度Ⅰ级患者的脑动脉粥样硬化病变程度较轻，随着眼底动脉硬化分级的增加，脑动脉粥样硬化程度也趋于严重。

3 讨论

3．1血管稀疏是视网膜老化主要特征在小鼠发育早期，我们可以看到小鼠视网膜血管从视乳头开始向周围呈辐射状生长。出生14 d后，小鼠视网膜血管已遍布视网膜各层，至成年趋于稳定[17-19]。随着小鼠日龄增加，老龄小鼠的视网膜血管丛变得稀疏，血管之间的吻合支较少，血管分支减少，管径变细，血管体密度下降。有资料表明，在发育过程中视网膜细胞壁发生纤维化，同时伴随血压升高和血脂异常引起的暂时性或持续性微血管损害，进而视网膜动脉发生狭窄、收缩，导致小鼠视网膜动脉管径变细[20-22]。在持续的高血压状态下，血-视网膜屏障遭到局部破坏，导致血管通透性增加，并伴随血管内皮损伤等因素，小鼠视网膜血管发生退行性变化，小鼠的视网膜血管网密度下降，血管丛较为稀疏[23-26]。同时，由于小鼠细胞因子分泌的变化等因素，小鼠视网膜吻合支减少，因此，小鼠视网膜整体处于老化状态。

3．2眼底动脉硬化与脑动脉粥样硬化有正相关关系脑动脉粥样硬化症是老年人较为常见的神经系统疾病，其主要特征是颅内血管弥漫性硬化、管腔狭窄及小血管闭塞，导致供应脑实质的血流减少，神经细胞发生变性所引起的一系列神经与精神症状[27]。临床早期常出现头痛、头晕、耳鸣、失眠、记忆力减退、四肢麻木、情绪不稳定等症状，随着病程进展，继而发生脑供血不足、脑卒中、血管性痴呆等较为严重的疾病[28-32]。有文献指出，高血压、高血脂、心功能分级的危险因素和心脑动脉硬化有直接关系[33-34]，脑动脉粥样硬化好发于大脑的基底动脉和大脑中动脉等部位，视网膜血管与大脑的基底动脉和中动脉所处环境相似，且管壁较薄，周围保护组织较少，因此，视网膜血管变化可敏感地反映出基底动脉和大脑中动脉硬化状况[35-40]。

图2 成年和老龄小鼠的血管密度统计 与成年小鼠相比，老龄小鼠的血管密度明显下降，P<0.01，**P<0.01Figure 2 The histogram of vascular density in adult and aged mice.Compared with adult mice，the vascular density of aged mice declines dramatically，**P<0.01

图3 A：对照组患者眼底动脉分布均匀，血管分支走形正常，视盘与黄斑发育正常；B：颅内磁共振血管成像结果可以看到对照组患者颅内动脉走形自然，管壁光滑，分布未见明显异常；C：颈内动脉管径对称，内-中膜厚度正常，回声均匀，流速正常Figure 3 A：Result of ophthalmoscopy：the distribution of the fundus arteries was uniform，the evenly distributed fundus artery runs mildly and the optic disc and macular development are normal；B：Intracranial MRA shows the cerebral arterial branch is rich in natural form of uniform distribution and smooth wall；C：The carotid artery ultrasonography examination fund the internal carotid is symmetrical in homogeneous echogenicity of normal IMT and normal flow velocity

视网膜动脉硬化诊断一般采用Keith-Wagener分级[41]方法。早期仅表现为功能性狭窄、动静脉压迹和管径比例的变化、动脉走行与分支的变化；随着动脉硬化的进一步发展，视网膜动脉管径出现明显的功能性狭窄，同时可能伴随出血、渗出、视乳头水肿等病变，影响患者视力，严重时可导致患者失明等[42-43]。视网膜中央动脉是脑循环系统的一部分，均为颈动脉分支，因此，二者血流变化具有同步性。由于年龄增加，视网膜血管壁局部纤维组织增厚变化与脑动脉血管具有一致性，颈动脉血压升高、血流流速的冲击等使得视网膜动脉与脑动脉的整体变化相似，且视网膜血管是人体唯一能够直接观察到的血管，变化较为灵敏。因此，视网膜动脉管径、分支及走形的变化对脑动脉变化的预测都具有临床意义，可较为方便地对脑血管状况进行评估。

本研究发现，眼底动脉硬化与脑动脉粥样硬化有正相关关系(P<0.01)，视网膜动脉硬化患者均伴一定程度的脑动脉粥样硬化病变，且随着眼底动脉硬化程度的增加，脑动脉粥样硬化程度愈加严重，即眼底动脉硬化状况与脑动脉粥样硬化病变程度存在正相关关系。通过本实验有理由相信，通过定期观察视网膜动脉硬化程度有利于对全身动脉硬化程度作出评估和对脑卒中等疾病的早期预防和控制，也可作为临床预后的指标，具有较高的理论与临床应用价值。因此，观察视网膜动脉硬化为脑动脉粥样硬化症的早期筛查、预防提供了更为便捷，高效，无创的诊断方法。

图4 A：视网膜动脉硬化患者的视网膜眼底血管动静脉管径比例下降，血管走形僵硬，出现动静脉压迹，小血管呈铜丝样外观；B：双侧颈内动脉颅内段管壁走行僵硬，右侧管腔狭窄，左侧血管局部狭窄，远端分支减少；C：双侧颈动脉内-中膜不均匀增厚(→)，回声不均匀，双侧颈动脉均有动脉硬化斑块形成Figure 4 A：Result of ophthalmoscopy revealed vascular attenuation of eyeground artery which has an abnormal route，"AV nicking" and "Copper Wiring" with irregularly located；B：Intracranial MRA demonstrate that the decrease in the distal vascular branches and the stenosis of intracalvarium of internal carotid artery in the left and the right；C：The carotid artery ultrasonography examination suggest an unequal thickening of IMT(→)，unequal echo and atherosclerosis plaques formation in the left and the right