大鲵希瓦氏菌的分离鉴定及其病理学观察

牛树辉，陈梦飞，吕帅飞，李声平，杨红飞，高小蝉

(河南科技大学 动物科技学院，河南 洛阳 471023)

大鲵(Andriasdavidianus)俗称娃娃鱼，隶属于隐鳃鲵科大鲵属，是世界上现存最大的两栖动物，也是我国重要的经济养殖物种。大鲵肉质鲜嫩、味道鲜美，富含优质蛋白质，具有很高的营养价值，同时还是一种名贵的传统药材。近年来，随着大鲵人工养殖规模的逐渐扩大，在饲养过程中出现了很多问题，其中疾病是影响大鲵规模化养殖的主要难题。细菌性病原是大鲵疾病的主要病原之一，给大鲵养殖业造成了巨大的经济损失，极大地影响了大鲵养殖业的健康发展。但是由于大鲵养殖范围的局限性，大鲵细菌性病原的生物学基础研究相对滞后。近年来，一些与大鲵病害相关的细菌性病原陆续被分离出来，包括嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)[1-3]、Ⅰ-型荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)[4]、维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)[5]、类志贺邻单胞菌(Plesiomonasshigelloides)[6]、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)[7]、摩氏摩根菌(Morganellamorganii)[8]和迟钝爱德华菌(Edwardsiellatarda)[9]等。

希瓦氏菌(Shewanellaxiamenensis)作为一种革兰氏阴性菌，隶属于弧菌科(Vibrionaceae)，目前已从水生环境、沉淀物、石油环境及冷藏食品中分离到20多株[10-11]。此外，希瓦氏菌也是多种水生动物的细菌性病原，其宿主不仅包括半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevisgunther)、大菱鲆(Psettamaxima)、异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)[12]、东风螺(Babylonia)[13-14]、海马(Hippocampus)[15]、大黄鱼(Pseudosciaenacrocer)[16]等海水养殖动物，还包括鲤鱼(Cyprinuscarpio)[17]、泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)[18]、乌苏里拟鲿(Pseudobagrusussuriensis)[19]等淡水养殖动物。近年来，其宿主范围不断扩大，对水产养殖业造成严重威胁，但目前尚未有希瓦氏菌作为两栖类动物病原的相关报道。

本研究利用平板划线法从患病大鲵中进行细菌分离，对分离菌进行革兰氏染色、透射电镜观察、16S rDNA序列鉴定、人工感染及药敏试验分析，并对患病大鲵进行病理学观察，为大鲵疾病的防治奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试动物 患病大鲵(体长为10～15 cm)由河南省洛阳市栾川县某大鲵养殖厂提供，健康大鲵由河南华鲵生物科技股份有限公司提供。

1.1.2 主要试剂 PCR引物合成及序列测定由生工生物工程股份有限公司完成；Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒、溶菌酶、DNA分子质量标准、TaqDNA聚合酶、dNTP均购自TaKaRa公司；DNA凝胶回收试剂盒购自Transgene公司；胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、琼脂、磷钨酸(Phosphotungstic acid，PTA)均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 主要仪器 数显恒温水浴锅购自常州朗越仪器制造有限公司；培养箱购自上海智城分析仪器制造公司；轮转式切片机购自浙江金华科迪仪器设备有限公司；PCR仪购自美国Applied Biosystems公司；透射电镜购自日本JEOL公司。

1.2 病原菌的分离培养、革兰氏染色及镜检

从患病大鲵中选取症状典型的濒死大鲵，用75%乙醇对大鲵体表进行消毒，在超净工作台中取出一小块肝脏和脾脏组织，研磨后分别在普通LB培养基平板上进行划线，并于37 ℃培养24 h后，挑取形态基本一致的单菌落，再进行3次划线培养，获得纯化的病原分离菌株。将分离到的各菌株接种到LB液体培养基中进行扩大培养后，一部分加甘油于-80 ℃保存备用[20]，另一部分进行革兰氏染色并置于显微镜下观察细菌的形态。

1.3 分离病原菌的基因组DNA提取及16S rDNA序列的PCR扩增

依照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取分离病原菌的基因组DNA。设计的16S rDNA通用引物为16S rDNA-F：5′-GAAAGGTTGATGCCTAATACGTA-3′；16S rDNA-R：5′-CGTGCTGGCAACAAAGGACAG-3′，预计扩增片段长度为1 459 bp。以各分离病原菌株的基因组DNA为模板，以16S rDNA-F/R为引物进行PCR扩增。PCR反应体系为25 μL：模板DNA 1 μL，上下游引物各1 μL，TaqDNA聚合酶 0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL,ddH2O 17 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸45 s，共32个循环；72 ℃延伸10 min后置于4 ℃保存备用。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，利用DNA凝胶回收试剂盒回收目的产物并送测序。

将测序结果用BLAST软件在NCBI上进行同源性搜索，然后分别用Clustal 1.83软件和MEGA 5.0软件进行序列对比并绘制系统进化树[21]。

1.4 分离病原菌培养基的初步优化

首先，分别以牛肉膏、葡萄糖、蔗糖作为菌株培养的唯一碳源，分别以蛋白胨、酵母粉和胰蛋白胨作为菌株培养的唯一氮源，分别以NaCl、MgSO4、K2SO4作为菌株培养的唯一无机盐；固定添加0.4%碳源、1.0%氮源、0.4%无机盐的基础LB液体培养基作为分离病原菌的培养基，并调整其pH值为7；然后接种5%分离病原菌于配制好的培养基中，37 ℃分别振荡培养24、36、48 h后测定OD600值，结合不同碳源、氮源、无机盐条件下分离病原菌的生长情况，选择出最适碳源、氮源、无机盐。其次，在确定最适碳源、氮源、无机盐后，通过调整其浓度并测定分离病原菌的生长情况，筛选出最适的碳源、氮源、无机盐的浓度。

1.5 分离病原菌的电镜观察

将覆盖有碳膜的铜网(孔径113 μm)粘在载玻片的双面胶上，正面朝上，分别取5 μL分离病原菌悬液样品滴至铜网上，于室温放置10 min后用滤纸吸去多余悬液。将铜网正面朝上置于蜡板上，滴加一滴2%的PTA后，避光染色3～4 min，再用滤纸吸去多余染液，晾干后进行电镜观察并拍照。

1.6 分离病原菌人工感染大鲵

取保存的分离病原菌株接种于LB液体培养基中，于37 ℃培养24 h，进行离心后重悬，参照MCFARLAND比浊法利用PBS将菌液浓度调整为1×108cfu/mL。

将健康大鲵先于室内暂养7 d，水温控制在(15±2)℃。然后将其随机分为2组，每组6尾，水温控制在(28±2)℃，分别对试验组每尾大鲵肌肉注射0.5 mL分离病原菌悬液，分别对对照组每尾大鲵肌肉注射等体积的PBS。分离病原菌的人工感染试验期间不进行投喂，每天换水一次，密切观察发病情况，并从濒临死亡的大鲵中分离病原菌。

1.7 分离病原菌的药敏试验

采用纸片扩散法(K-B法)进行药敏试验。取100 mL新鲜菌悬液(浓度约1×107cfu/mL)均匀涂布于LB固体培养基上，用无菌镊子将直径6 mm的药敏纸片(甲砜霉素、恩诺沙星、氟苯尼考、复方新诺明、多西环素、乳酸诺氟沙星、四黄抗毒、磺胺二甲氧嘧啶钠、硫氰酸红霉素、磺胺间甲氧嘧啶钠、保肝解毒宁、盐酸黄连素)均匀平贴在平板上，设3个重复。37 ℃培养24 h后测量抑菌圈直径。参照文献[22]进行结果判定，将抑菌圈直径在20 mm以上判定为极度敏感(E)、在15～20 mm判定为高度敏感(S)、在10～15 mm判定为中度敏感(I)、小于10 mm的判定为不敏感(R)。

1.8 患病大鲵组织病理学观察

取健康及患病濒死大鲵的肝脏、脾脏、肾脏和肺脏组织，经苦味酸固定液固定后，再经洗涤、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、脱蜡、水化、烤片、HE染色、封片等步骤最终制成组织切片，然后置于显微镜下观察各组织病理变化[23]。

2 结果与分析

2.1 患病大鲵的临床症状观察及剖检病理变化

患病大鲵体表黏液脱落，头部出现绿豆大小的白点或成片的白斑区域，腹部溃烂，四肢严重肿大、出血，皮肤有溃疡，部分趾甚至脱落，尾部溃烂。

剖检观察发现，患病大鲵肠内无食，肠胃之间有粘连，内有血丝和黄色黏液；肝脏明显肿大、充血或呈灰白色，甚至严重变形；胆呈黄色，肾脏肿大，脾脏出血甚至严重溃烂，部分肝脏和脾脏粘连，肺脏萎缩。

2.2 大鲵病原菌的分离与革兰氏染色

通过平板划线法共分离到5株大鲵的病原菌，包括肝脏中2株、脾脏中1株和肠中2株，分别编号为LY1—LY5。分离到的5株大鲵病原菌在LB平板上的菌体形态相似，均为表面光滑、边缘整齐、稍微隆起的圆形不透明的淡黄色菌落。对大鲵的病原菌进行革兰氏染色后通过镜检观察发现，菌株LY1—LY5的菌落形态一致，均呈红色、杆菌，因此均为革兰氏阴性杆菌。

2.3 大鲵病原菌的16S rDNA序列比对及系统发育进化树分析

如图1所示，PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳显示在1 500 bp左右有1条目的条带，与预期大小(1 459 bp)一致。从GenBank中选取最相似菌株的16S rDNA序列，与分离病原菌的测序结果进行序列比对，结果表明，大鲵分离病原菌株LY1—LY5的16S rDNA序列与希瓦氏菌的序列相似度高达99%，则分离病原菌株LY1—LY5为希瓦氏菌。同时，选择其中序列最长的分离病原菌株LY3作为代表株进行后续研究。由图2可知，在构建的大鲵分离病原菌的系统发育进化树中，菌株LY3与希瓦氏菌(Shewanellasp. NF20111223D，登录号：KC916743.1)同源性最高，亲缘关系最近。

M：DNA分子质量标准；C：阴性对照；

2.4 不同碳源、氮源以及无机盐的种类和添加量对大鲵分离病原菌生长的影响

由图3A可知，在培养24、36、48 h，选择蔗糖作为大鲵分离病原菌株生长的唯一碳源时，菌体生长最好，当固定牛肉膏和葡萄糖作为唯一碳源时，大鲵分离病原菌的生长相对较弱，因此选择蔗糖作为其生长培养基中的唯一碳源。由图3B可知，当蔗糖的添加量为0.3%时，菌体生长最佳。由图3C可知，在培养24、36、48 h，选择酵母粉作为大鲵分离病原菌株生长的唯一氮源时，菌体生长最好，而选择蛋白胨和胰蛋白胨作为唯一氮源时，菌体生长相对较弱，因此,选择酵母粉作为大鲵分离病原菌株生长培养基中的唯一氮源。如图3D所示，当酵母粉的添加量为1.2%时，菌体生长最佳。如图3E所示，在培养24、36、48 h，选择MgSO4作为大鲵分离病原菌株生长的唯一无机盐时，菌体生长最好，而当NaCl和K2SO4作为唯一无机盐时，菌体生长相对较弱，因此选择MgSO4作为菌体生长培养基中的无机盐。如图3F所示，当MgSO4的添加量为0.6%时，菌体生长最佳。

图2 大鲵分离病原菌株LY3的16S rDNA系统发育进化树Fig.2 16S rDNA phylogenetic tree of isolated bacterial strain

A：大鲵分离病原菌LY3在添加不同碳源的培养基中培养24、36、48 h后的生长情况；B：不同蔗糖添加量下大鲵分离病原菌的生长情况；

2.5 大鲵分离病原菌株LY3的透射电镜观察

如图4所示，经PTA负染后，在透射电镜下观察，大鲵分离病原菌株LY3均呈杆状，两端钝圆。

图4 分离菌株LY3的透射电镜图片Fig.4 Transmission electron micrograph of strain LY3

2.6 大鲵分离病原菌株LY3的人工感染试验结果

利用分离病原菌株LY3进行人工感染12 h后，大鲵表现为食欲减退且体表黏液开始脱落；人工感染60 h后，大鲵的四肢肿大并伴有出血，同时头部出现白点和溃疡，随后白点和溃疡在全身进一步扩大；人工感染72 h时，有4只大鲵死亡，至140 h时被感染大鲵全部死亡。对死亡大鲵进行剖检发现，其肝脏、脾脏均发生出血、肿大，同时还出现肾脏肿大，肺萎缩，肠内有黄色黏液等症状，与自然发病症状基本相同。而从人工感染发病死亡大鲵的肝脏和脾脏处分离到的病原菌经革兰氏染色后，镜检结果与自然分离的大鲵病原菌株LY3的形态一致，表明LY3是大鲵的致病菌。

2.7 大鲵分离病原菌株LY3的药敏试验结果

如表1所示，通过药敏试验发现，大鲵分离病原菌株LY3对恩诺沙星极度敏感，对氟苯尼考、磺胺间甲氧嘧啶钠、乳酸诺氟沙星、硫氰酸红霉素高度敏感，对复方磺胺甲噁唑粉(复方新诺明)、甲砜霉素、磺胺二甲氧嘧啶钠、四黄抗毒、多西环素、保肝解毒宁中度敏感，对盐酸黄连素耐药。

2.8 患病大鲵组织病理学观察

由图5所示，对照组健康大鲵的肝脏切片中肝脏细胞呈多角形，细胞紧密排列，细胞边界明显，组织被肝窦分成很多肝小叶；而感染组患病大鲵的肝脏组织空泡化严重，细胞浑浊，肝小叶间界限不分明，肝板排列紊乱。对照组健康大鲵的脾组织中红髓和白髓分界清楚，脾细胞均匀排列；感染组患病大鲵的脾脏组织中红髓和白髓分界不清楚，大量的嗜酸性细胞堆集，有大量褐色颗粒出现，多数细胞核溶解，出现大量空泡样变的细胞。对照组健康大鲵的肾脏组织中髓质、肾小管结构清晰，近曲小管和肾小管边界清晰，细胞均匀排列，细胞核居中，有些囊腔中出现蛋白质分泌物，肾小球细胞核居中排列；感染组患病大鲵的肾组织坏死，肾小管和肾小球结构破坏，肾小囊溶解坏死，肾小管裂解，细胞边界不清晰，有些细胞核消失，在管腔中有大量炎性细胞浸润。对照组健康大鲵的肺组织中肺泡管、肺泡囊和肺泡结构清晰，细胞排列均匀；感染组患病大鲵的肺组织中细胞核堆集，细胞排列紊乱，肺泡囊不明显，组织纤维化。

表1 大鲵分离病原菌株LY3对水产常用药物的敏感性试验分析Tab.1 Analysis of drug-sensitivity test of isolated bacterial strain LY3 from Andrias davidianus

注：E(极度敏感)：抑菌圈直径>20 mm；S(高敏)：15 mm≤抑菌圈直径≤20 mm；I(中敏)：10 mm≤抑菌圈直径<15 mm；R(耐药)：抑菌圈直径<10 mm。

Note: E(Extremely sensitive): Inhibition zone diameter>20 mm; S(Highly sensitive): 15 mm≤Inhibition zone diameter≤20 mm; I(Moderately sensitive): 10 mm≤Inhibition zone diameter<15 mm; R(Resistant): Inhibition zone diameter<10 mm.

图5 大鲵感染前后不同组织切片的比较病理学分析Fig.5 Comparative analysis of histopathological features of different issues from healthy giant salamander and Shewanella xiamenensis-infected giant salamander

3 结论与讨论

目前报道的希瓦氏菌主要是从水生环境或沉淀物中分离得到，另有少数腐败希瓦氏菌是从冷藏的鱼类中分离得到[10,24]，但关于其作为细菌性病原的研究较少。有研究表明，希瓦氏菌作为条件致病菌能够感染多种水生动物，可致大黄鱼体侧、腹部、鳍基、下颌、鳃盖等发红，使异育银鲫的腹部出血、膨大，引起乌苏里拟鲿体表溃疡症，还能够引起泥鳅的腹部和肛门处出现明显红点和红斑。本研究从大鲵中首次分离到希瓦氏菌，被该病原菌感染后的大鲵可产生皮肤溃疡、出血等症状，且利用分离出的病原菌进行人工感染后的大鲵症状与自然发病大鲵症状基本相同，并且从人工感染大鲵中分离出的菌株与自然发病大鲵体内分离出的菌株形态相同。

近年来，药敏试验广泛应用于水产动物病害的检测，但主要是采用兽用药敏纸片进行，少有以水产动物专用药敏纸片进行的药敏试验，使其在水产养殖实际应用中存在很大的局限性[25]。贾春红等[13]测定了3株方斑东风螺的病原希瓦氏菌对35种常用抗菌药物的敏感性，其中腐败希瓦氏菌和海藻希瓦氏菌对复方新诺明敏感[16]。秦蕾等[12]从异育银鲫中分离到的腐败希瓦氏菌对氟苯尼考、恩诺沙星等敏感。林锋等[18]分离的泥鳅源希瓦氏菌对复方新诺明、四环素等高度敏感。本研究结果显示，分离出的大鲵希瓦氏菌LY3对恩诺沙星的敏感性最强，对氟苯尼考、磺胺间甲氧嘧啶钠、乳酸诺氟沙星和硫氰酸红霉素次之，与秦蕾等[12]的报道有相似性，与贾春红等[13]和林锋等[18]的报道不同，推测可能是由于不同种类水生动物的希瓦氏菌对抗生素的敏感性不同。

针对水生动物细菌性疾病治疗，水产养殖一直依赖消毒剂和抗生素，但近年来抗生素在水产品领域产生诸多负面影响。中草药、中草药提取物甚至中药复合制剂凭借其毒副作用小、不易引发耐药性等特点，得到日益广泛的重视与研究，如五倍子、黄芩、五味子、苦地胆、黄连、大黄等对黄颡鱼温和气单胞菌的抗菌效果较好[26]，五倍子、穿心莲、杨树花组成的复方对黄鳝源嗜水气单胞菌的抑菌效果较好[27]。本研究中用到3种水产类常用的中药制剂(盐酸黄连素、四黄抗毒和保肝解毒宁)，其中四黄抗毒和保肝解毒宁对大鲵希瓦氏菌有一定的抑制作用，但效果均不理想，可能是由于中药制剂与抗生素的作用机制不同，相比之下中药制剂更适于调节动物机体的免疫功能。

综上所述，本研究中引起大鲵患病的病原为希瓦氏菌，该菌株引起的大鲵疾病可用恩诺沙星进行治疗。本研究为大鲵的养殖管理提供了参考，并为同批次大鲵的治疗提供了可靠的依据。