支原体肺炎患儿外周血Th17，Treg细胞亚群和细胞因子表达及CRP，PCT水平的研究*

屠昌明，田 园

(中国人民解放军联勤保障部队第901医院检验科，合肥 230031)

肺炎是儿科多发病，可由多种病原体感染发病，其中支原体肺炎(Mycoplasmapneumonia，MPP)近年来有明显增高趋势，在儿童社区获得性肺炎中约占10%～30%[1]，是由肺炎支原体(Mycoplasma，MP)引起的下呼吸道感染性疾病[2]，患儿临床症状主要表现为刺激性干咳。目前，支原体肺炎的发病机制尚不完全清楚，有研究提示免疫细胞Th17/Treg比例失衡可能参与了儿童支原体肺炎的发生发展[3]。本研究旨在探讨支原体肺炎儿童外周血Th17和Treg细胞亚群及相应细胞因子表达水平的变化以及C-反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)在临床疗效判断中的价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2017年1月～2018年8月来我院儿科就诊的支原体肺炎患儿75例作为实验组，纳入标准：患儿符合支原体肺炎诊断标准[4]，刺激性干咳典型并且持续，ELISA方法检测血清特异度MP-IgM≥1∶40即为MP感染阳性。病程均在一周以内，并且排除先天性疾病、免疫系统疾病及其他炎症性疾病。入选患儿男性40例，女性35例，平均年龄5.5±2.7岁。选择同期来我院体检的健康儿童75例作为对照组，其中男性38例，女性37例，平均年龄5.8±2.6岁。两组对象在年龄和性别方面差异无统计学意义(P>0.05)，结果具有可比性。本次研究获得医院伦理委员会批准，所有参与儿童均知情同意。

1.2 试剂和仪器 流式细胞仪购自美国BD公司，采用配套试剂检测Th17和Treg细胞；细胞因子检测采用商品化ELISA试剂盒，购自美国R&D公司；CRP检测使用日立7600全自动生化分析仪及配套试剂；PCT检测使用梅里埃VIDAS全自动免疫分析仪及配套试剂。

1.3 方法 实验组患儿入院时空腹采集静脉血样本，分别检测Th17和Treg细胞百分比、IL-17和IL-10表达水平、CRP和PCT，治疗一周后再次空腹采集静脉血检测CRP和PCT。对照组儿童来院体检时采集静脉血样本，分别检测Th17和Treg细胞百分比、IL-17和IL-10表达水平、CRP和PCT。分离外周血单个核细胞(PBMC)具体操作步骤参考仪器说明书，以CD3+/CD8-/IL-17+设门，检测外周血中Th17细胞比例；以CD4+/CD25+/Foxp3+设门，检测外周血中Treg细胞比例。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测外周血中IL-17和IL-10的表达水平，具体操作步骤详见试剂盒说明书。3 500 r/min离心10 min取上层血清分别上仪器检测CRP和PCT。所有实验操作严格执行标准化操作规程。

2 结果

2.1 实验组与对照组外周血Th17，Treg细胞，IL-17，IL-10，CRP和PCT水平比较 见表1。实验组外周血Th17细胞百分比、IL-17的表达水平、CRP和PCT水平均高于对照组，差异均具有统计学意义(均P<0.05)；实验组外周血Treg细胞的百分比和IL-10的表达水平均低于对照组，差异具有统计学意义(均P<0.05)。

表1 外周血Th17，Treg细胞，IL-17，IL-10，CRP和PCT结果统计分析

2.2 实验组治疗一周前后外周血CRP和PCT水平比较 见表2。实验组治疗一周后外周血CRP和PCT水平均降低，与治疗前相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表2 实验组治疗一周前后外周血CRP和PCT结果统计分析

3 讨论

3.1 近年来支原体已经成为儿童呼吸道感染的重要病原体[5]，呈流行趋势，并且发病呈现低龄化，除了引起严重的肺部感染，可累及多器官、多系统损伤，有文献报道支原体肺炎儿童肺外器官受累可高达40%，以心肌炎、脑炎多见[6]。到目前为止，临床对支原体肺炎的发病机制尚不明确，普遍认为儿童感染支原体以后，病原体依靠黏附蛋白黏附于肺部上皮细胞表面受体，通过吸收宿主细胞营养进行大量繁殖，同时释放有毒代谢产物改变宿主细胞表面抗原结构，导致患儿免疫机制发生病理性改变，特别是细胞免疫功能障碍[6-7]，严重危害儿童身心健康。

支原体作为细胞寄生菌，可以侵入宿主细胞内，逃避机体的免疫监视。单核-巨噬细胞作为机体重要的抗原提呈细胞，能够将支原体抗原分子呈递给未分化的Th0细胞，并刺激其活化成为Th1，Th2和Th17，Treg细胞，这些免疫细胞可以合成并分泌多种细胞因子[8]。有研究表明辅助性T细胞亚群及其细胞因子在支原体发病机制中起着非常重要的作用[9-11]。Th17细胞主要通过分泌IL-17促进和放大炎症反应，Treg细胞通过分泌IL-10抑制T细胞的活化和增殖，对免疫细胞起负向调节作用[12]。在机体正常状态下，Th17和Treg细胞相互制约，共同维持机体免疫功能的动态平衡[12]。本次实验结果显示，支原体感染发生后，患儿外周血Th17细胞增加，Treg细胞减少，Th17/Treg比例失衡，由其分泌和调节的细胞因子IL-17和IL-10表达异常，这与之前的报道结果一致[13-15]，表明Th17/Treg细胞失衡以及相应细胞因子表达异常可能参与了儿童支原体肺炎的发生发展。前期研究结果证实Notch信号通路参与调节Th17，Treg的细胞分化和细胞因子的分泌[16-17]，我们推测这可能是支原体肺炎儿童外周血Th17/Treg细胞失衡的分子机制。由于检测仪器和试剂成本昂贵，实验组患儿治疗后Th17/Treg细胞比例以及相应细胞因子表达水平均未进行检测，参考对照组检测结果已经可以推断其逐步恢复至平衡，目前为减轻患儿经济负担不建议临床将此项进行常规检测。

3.2 C-反应蛋白(CRP)是一种急性时相反应蛋白，当机体受到病原体入侵或组织损伤等炎症性刺激时由肝细胞合成，在感染发生后的6～8 h开始升高，1～2天内达到峰值，最高可达正常值的10～100倍，在感染消除后急骤下降，一周内可恢复正常。CRP水平与组织损伤后的修复程度关系密切，不会受到性别、年龄、贫血等因素的影响。因此CRP可以用于感染的早期发现和疗效判断，由于其价格低廉、结果可靠，目前已经作为入院检查的常规指标。降钙素原(PCT)是由甲状腺C细胞产生的一种糖蛋白，正常人外周血中含量低于0.05 ng/ml。文献报道PCT在细菌感染性疾病中升高明显[18]，支原体具有类似革兰阴性菌的内毒素及脂多糖作用，可能是由于内毒素和细胞因子参与抑制了PCT的分解，释放入血以后导致外周血中含量升高[17]。在已知的感染检测指标中，PCT在外周血中出现最早，在感染发生6 h之内即可明显升高。已有研究[19-20]认为外周血中CRP和PCT水平的变化与支原体肺炎患儿病情进展具有一定的关系，联合检测患儿外周血CRP和PCT水平，对诊断支原体肺炎的灵敏度和特异度可接近58%左右。本次研究旨在讨论CRP和PCT在已经确诊的支原体肺炎患儿病情观察和疗效判断中的意义，结果显示支原体感染发生后，患儿外周血CRP和PCT水平均明显升高，经过有效治疗以后，外周血CRP和PCT水平均下降明显，二者在病情观察和疗效判断上具有很好的应用价值。

综上所述，支原体肺炎患儿外周血Th17/Treg细胞比例失衡和相应细胞因子表达异常，可能参与了儿童支原体肺炎的发生发展，这为今后临床开展免疫治疗提供了理论基础和崭新的方向。联合检测外周血CRP和PCT水平在支原体肺炎患儿早期诊断，特别是在病情观察和疗效判断上具有重要价值，值得临床推广应用。