年龄、BMI、吸烟和饮酒对男性精子印记基因CpG位点甲基化的影响

刘志朝，杨佳，王莉，强梅

(山西医科大学，太原030001)

遗传印记又称基因组印记，是指子代中特定基因、基因簇仅表达父源或母源的等位基因，而另一侧亲本等位基因沉默的可遗传表观修饰现象[1]。表观遗传修饰包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA调控等。DNA甲基化与男性不育、胚胎发育的关系已成为生殖与发育领域的研究热点。有学者[2]发现，精子DNA全基因组高甲基化组的配偶受孕率明显高于低甲基化组。H19为位于人染色体11p15.5的父系印记基因，大量研究表明精子H19基因低甲基化与男性不育有关[3]。Peg3是位于人染色体19q13.4、小鼠7号染色体近端的母系印记基因。Meg3是位于人染色体14q32.3、小鼠12号染色体远端的父系印记基因。敲除印记基因Peg3或Meg3的小鼠出现胚胎生长受限或死亡[4,5]，Peg3、Meg3甲基化可能与胚胎发育有关。有研究认为，在成熟精子中，与胚胎生长发育密切相关的基因启动子甲基化水平低，而DNA甲基化异常会导致胚胎异常发育和生长[6]。但多数相关研究受样本量较少限制，不易对混杂因素予以控制。因此，笔者开展了较大样本量研究，观察不同年龄、BMI、吸烟和饮酒状况等一般人口学特征的男性精子H19、Peg3、Meg3基因甲基化水平的分布情况，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2015年3～4月和2016年3～4月于山西省妇幼保健院生殖中心男科进行孕前检查的已婚男性(年龄22～60岁)纳入研究。排除家族有遗传病史、不育史者，精液过少者(<0.5 mL)。所有参与研究人员均签署知情同意书。自行设计结构式问卷，内容包括人口学特征、生活习惯、既往病史和心理健康状况等，由培训合格的调查员进行面对面调查。其中吸烟为平均每日吸烟1支或以上，持续1年以上；饮酒为平均每周至少饮酒1次，每次100 g或以上，持续1年以上。共有702人配合填写问卷，其中605人提供精液样本，共成功获得440人的DNA甲基化检测结果。440人中，年龄22～58岁，<30岁192人(43.6%)、30～34岁167人(38.0%)、35～39岁53人(12.0%)、>39岁26人(5.9%)；BMI 17.1～38.4，<18.5(体质量偏低)12人(3.4%)、18.5～23.9(正常)168人(38.2%)、24.0～27.9(超重)152人(34.5%)、≥28(肥胖)104人(23.6%)；吸烟233人(53%)、不吸烟203人(46.1%)、缺失4人；饮酒128人(29.1%)、不饮酒308人(70%)、缺失4人。缺失为问卷资料填写不完整。问卷各项目缺失情况不重叠。

1.2 精子DNA甲基化水平检测

1.2.1 精子DNA提取 研究对象禁欲3～7 d，手淫法收集全程精液，-80 ℃保存。用胍硫氰酸盐沉淀法提取精子DNA。于1.5 mL的EP管中加入样品200 μL和PBS缓冲液1 000 μL，混匀后1 500 g冷冻离心10 min，共清洗3次，以清除细胞外的物质；弃上清，加裂解液500 μL，55 ℃水浴12 h；取出水浴的EP管，冷却至室温，加RNA酶10 μL，混匀，室温孵育10 min；加等体积异丙醇，颠倒10次，16 000 g离心10 min；弃上清，加75%乙醇800 μL于EP管中，颠倒10次，16 000 g离心10 min，放置于-20 ℃数小时；再清洗1次后弃上清，待乙醇自然挥发干；加E5 30 μL于EP管中，65 ℃水浴2 h使DNA充分溶解。检测DNA浓度和纯度，取浓度大于50 ng/μL、A260/A2801.7～2.0的DNA样本。

1.2.2 DNA的亚硫酸氢盐修饰 使用EZ Methylation Gold-Kit试剂盒，根据产品说明书对DNA进行亚硫酸氢盐修饰。在20 μL的DNA提取液(1 000 ng DNA)中加入130 μL的CT转换试剂，放置于PCR仪上，进行加热变性；冷却后将其添加至含有600 μL M-Binding Buffer的Zymo-SpinTM柱子中，10 000 g离心30 s；柱子中加入100 μL的M-Wash Buffer清洗，10 000 g离心30 s；加入200 μL的M-Desulphonation Buffer，室温孵育15 min，10 000 g离心30 s；加入200 μL的M-Wash Buffer，10 000 g离心30 s，清洗2次；分2次共加入15 μL的M-Elution Buffer，10 000 g离心30 s，以洗脱附着在柱子膜上的DNA。取浓度>30 ng/μL、A260/A280>1.9的DNA进行后续实验。

1.2.3 H19、Peg3、Meg3基因甲基化水平检测 用PyroMark PCR Kit试剂盒对进行PCR扩增；再经单链PCR产物纯化、测序引物杂交等步骤后使用PSQ96焦磷酸测序仪及PyroMark Gold Q96 Kit试剂盒对H19、Peg3、Meg3基因的目的片段进行甲基化水平的检测。测序过程参考文献[7]。每个基因甲基化差异区(DMR)分析的CpGs位点数目∶H19基因7个，Meg3基因8个，Peg3基因7个。PCR引物序列见表1。

表1 H19、Meg3、Peg3基因的DMR区正向、反向引物及测序引物序列(5′→3′)

1.3 统计学方法 采用SPSS24.0统计软件。采用K-S检验进行正态性检验，除H19基因的CpG3位点数据外(P=0.2)，其余各印记基因位点数据均不服从正态分布(P<0.05)，因此以中位数描述数据。不同年龄、BMI者基因甲基化水平比较采用Kruskal-WallisH检验，对有差异的项目通过Nemenyi检验进行两两比较；不同吸烟、饮酒情况者基因甲基化水平比较采用Wilcoxon秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同人口学特征者H19基因各CpG位点甲基化水平比较 H19基因甲基化数据缺失1例。不同年龄、BMI、饮酒情况者H19基因各CpG位点甲基化水平差异无统计学意义。吸烟者H19基因CpG2、CpG7位点甲基化水平高于非吸烟者(P均<0.05)，去除极端值后差异仍有统计学意义(CpG2位点数据去除0个，CpG7位点数据去除1个，P=0.043)。详见表2。

表2 不同人口学特征者H19基因各CpG位点甲基化水平比较(%)

2.2 不同人口学特征者Peg3基因各CpG位点甲基化水平比较 不同年龄、BMI、吸烟情况、饮酒情况者Peg3基因各CpG位点甲基化水平差异均无统计学意义。详见表3。

表3 不同人口学特征者Peg3基因各CpG位点甲基化水平比较(%)

2.3 不同人口学特征者Meg3基因各CpG位点甲基化水平比较 不同年龄、饮酒情况者Meg3基因各CpG位点甲基化水平差异无统计学意义。不同BMI者Meg3基因CpG8位点甲基化水平差异有统计学意义，进一步组间两两比较，差异无统计学意义;其余CpG位点甲基化水平差异无统计学意义。吸烟者Meg3基因CpG2位点甲基化水平高于与非吸烟者(P=0.035)，去除7个极端值后组间比较仍有统计学差异(P=0.014)。详见表4。

表4 不同人口学特征者Meg3基因各CpG位点甲基化水平比较(%)

3 讨论

目前精子DNA甲基化在男性不育、不良妊娠结局的表观遗传机制相关研究中逐渐受到重视，但类似机制研究样本量普遍较少，因此笔者进行了较大样本量研究来描述不同人口学特征男性精子印记基因甲基化的分布情况，以期为相关研究控制混杂因素提供理论基础。

有学者[8]发现随年龄增长精子DNA有138个区域的甲基化水平降低，8个区域甲基化水平增高。该研究者进一步比较47名平均年龄为20.46岁的青年男性与19名平均年龄为47.71岁的男性精子DNA 15个区域的甲基化水平，发现组间仍有差异，因此认为年龄与这些基因组位点的甲基化改变有关[8]。有学者[9]检测了精子DNA中9个印记基因的甲基化水平，发现其中有4个基因甲基化水平与年龄相关。但本研究并未发现不同年龄组精子H19、Peg3、Meg3基因DMR区域各CpG位点甲基化水平的差异。分析原因：本研究所涉及的精子3个印记基因的甲基化水平可能不随年龄的增长而变化；本研究高年龄组平均年龄较低(43.19岁)，可能导致了结果的差异。

Soubry等[10]对46例BMI正常男性和23例超重或肥胖男性精子印记基因甲基化水平进行比较，发现超重或肥胖组精子Meg3、NDN、SNRPN、Peg10基因甲基化水平降低；而Meg3-IG、H19基因甲基化水平升高。但另一项对3只肥胖小鼠和3只对照小鼠精子的研究发现，H19、IGF2、Meg3-IG、IGF2R、MEST、Peg3、NNAT、SNRPN基因的DMR甲基化水平没有发生显著改变[11]。本研究也未发现BMI正常、体质量偏低、超重和肥胖男性精子H19、Peg3、Meg3基因DMR甲基化的差异。本研究的数据支持男性BMI与精子H19、Peg3、Meg3基因DMR甲基化水平无关。

有研究称吸烟可造成精子基因组甲基化水平升高[12]。一项对21名吸烟男性和57名不吸烟男性的研究发现，精子DNA中141个CpG位点甲基化水平与吸烟有关[12]。本研究进一步发现，吸烟男性精子H19基因的CpG2、CpG7位点和Meg3基因的CpG2位点甲基化水平升高。多项研究表明，吸烟与男性不育有关[13]，且H19基因甲基化的改变与精液参数相关[14]。印记基因甲基化水平升高会使其表达水平降低[15]。现已证实肿瘤细胞中H19、Meg3高表达，胚胎发育过程中H19高表达[16]，精子生成过程中也有类似的细胞增殖的过程。因此，结合本研究的结果，笔者推测吸烟可能导致精子H19、Meg3基因甲基化水平升高而降低二者的表达水平，从而降低精液质量。

研究报道，雌鼠孕期10～18 d口服乙醇，F1代小鼠精子H19基因CpG岛甲基化水平相比对照组降低了3%，Gtl2、Peg1、Snrpn、Peg3基因甲基化与对照组无统计学差异[17]。一项研究发现，中度饮酒组H19基因第7个CpG位点甲基化水平与不饮酒组、重度饮酒组有统计学差异，重度饮酒组Ig-DMR甲基化水平与其他两组有统计学差异[18]。饮酒对精子印记基因甲基化的影响尚无定论。本研究的数据也提示，不同饮酒状况的人群中，精子H19、Peg3、Meg3基因DMR甲基化水平无统计学差异。

综上所述，本研究发现不同年龄、BMI和饮酒情况的男性精子H19、Peg3、Meg3基因甲基化水平无统计学差异；有吸烟习惯的男性精子H19基因的CpG2、CpG7位点和Meg3基因的CpG2位点甲基化水平高于非吸烟者。下一步将有针对性地探讨不同印记基因甲基化水平的影响因素，并在可能的条件下通过队列研究探讨印记基因甲基化水平与不孕不育的关系。