丹参酮IIA对膀胱癌T24细胞增殖、凋亡和细胞周期蛋白B1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3表达的影响*

唐荣金，曾宪华，石海林，孙文国，向雪宝，蒋雷鸣，高漓

（桂林医学院附属医院 泌尿外科，广西 桂林 541001）

丹参酮IIA（tanshinone IIA, TanIIA）是来源于中药丹参的有效提取物，既往研究认为TanIIA具有抗炎症反应的功效，可预防血管粥样硬化及心肌肥厚，减轻因缺血再灌注引起的肾损[1-2]。近年，TanIIA对恶性肿瘤的抗癌作用及其机制研究也得到越来越多的关注，但是对于其在膀胱癌的作用研究却少见[3]。本研究拟探索TanIIA对人膀胱癌T24细胞增殖及凋亡的作用及对细胞周期蛋白B1（CyclinB1）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3信使核糖核酸（Caspase-3 mRNA）表达的影响，旨在为治疗膀胱癌探寻一条低毒高效的道路。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂

人膀胱癌T24细胞株购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。DMEM（Dulbecco's modified eagle medium, DMEM）培养基（美国Gibco公司）；MTT（美国Sigma公司）；AnnexinV/ PI双染试剂盒（凯基生物）；逆转录-聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）试剂盒（美国Promega公司）；引物及内参引物及内参（上海生工生物工程公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 用含10%胎牛血清DMEM培养基，于37℃、5%二氧化碳（CO2）培养箱中培养细胞。每3 d换液1次，并传代培养，培养细胞至对数生长期。

1.2.2 MTT检测细胞增殖 取对数生长期的细胞接种于96孔板，每孔细胞数1×104。培养板放入箱中，在37℃、5% CO2条件下细胞培养24 h培养。取出培养板，加入不同浓度（5 mg/L和10 mg/L）TanIIA，细胞培养箱中孵育48 h。MTT稀释后，在37℃孵育4 h，每孔加入二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）150 ul，充分振荡10 min。用酶标仪在570 nm波长下检测各孔的吸光度。细胞存活率=［加药细胞光密度（optical density, OD）/对照细胞OD］×100%。

1.2.3 AnnexinV/PI检测细胞凋亡 将TanIIA处理T24细胞48 h，后按AnnexinV/PI试剂盒说明书操作。

1.2.4 RT-PCR 检测CyclinB1和Caspase-3 mRNA取与1.2.2同组的T24细胞，提取细胞总RNA，参照RT-PCR试剂盒说明书进行操作。

1.3 统计学方法

用SSPS 19.0统计软件处理分析所得数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用多个样本均数间两两比较的方差分析，各组间比较应用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法检测TanIIA对人膀胱癌T24细胞体外增殖的影响

MTT结果显示：不同浓度TanIIA对膀胱癌T24细胞有抑制作用，而且随着浓度的增加，增殖抑制愈加明显，呈浓度依赖性，各组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 不同浓度TanII对T24细胞增殖的影响（MTT法） （±s，%）

表1 不同浓度TanII对T24细胞增殖的影响（MTT法） （±s，%）

注：1）与空白对照组对比，P＜0.05；2）与5 mg/L对比，P ＜0.05。

药物浓度 48 h存活率空白对照组 0.942±0.072 5 mg/L 0.753±0.0461）10 mg/L 0.529±0.0531）2）

2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡

AnnexinV/PI结果显示，凋亡率分别随着浓度增长而增加，呈浓度依赖性，各组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 不同浓度TanII对T24细胞凋亡率的影响（AnnexinⅤ/PI法） （±s，%）

表2 不同浓度TanII对T24细胞凋亡率的影响（AnnexinⅤ/PI法） （±s，%）

注：1）与空白对照组对比，P＜0.05；2）与5 mg/L对比，P ＜0.05。

药物浓度 48 h凋亡率空白对照组 0.453±0.047 5 mg/L 7.428±0.5811）10 mg/L 12.742±1.4741）2）

2.3 RT-PCR检测T24细胞中CyclinB1和Caspase-3 mRNA的表达

RT-PCR分别检测处理48 h后T24细胞的CyclinB1和Caspase-3 mRNA表达，发现CyclinB1 mRNA表达随TanIIA浓度增高而下调，而Caspase-3 mRNA则表达上调，两者均呈浓度依赖性，各组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 RT-PCR检测不同浓度TanIIA处理T24细胞48 h后CyclinB1和Caspase-3 mRNA的表达（n =4） （±s）

表3 RT-PCR检测不同浓度TanIIA处理T24细胞48 h后CyclinB1和Caspase-3 mRNA的表达（n =4） （±s）

注：1）与空白对照组对比，P＜0.05；2）与5 mg/L对比，P ＜0.05。

药物浓度 CyclinB1 Caspase-3 t值 P值空白对照组 0.291±0.027 0.163±0.031 2.76 0.013 5 mg/L 0.204±0.0211 0.307±0.0741） -3.931 0.001 10 mg/L 0.138±0.0161）2） 0.537±0.0521）2） -28.74 0.000

3 讨论

膀胱癌在恶性肿瘤中位居第7位，大部分为尿路上皮癌，其中局限性尿路上皮癌可分为肌层非浸润性膀胱癌（non muscular-invasive bladder cancer, NMIBC）和肌层浸润性膀胱癌（muscular-invasive bladder cancer, MIBC），NMIBC约 占75%～80%，MIBC及发生转移的患者往往需要根治性膀胱切除、化疗或放疗[4]。即使行膀胱癌根治性切除术，仍可能有约1/2的MIBC患者发现复发或转移，然而无论是经典的顺铂方案，还是近来迅速发展的靶向治疗，均存在有效率不明确且副作用较为明显的特点[5]。因此，如何在祖国传统医学宝库中发现一条低毒高效的膀胱癌治疗道路，已成为肿瘤学的研究热点。

TanIIA作为中药丹参的有效成份之一，具有脂溶性，除了应用于心血管等疾病，拥有抗氧化、抗炎症等特点外，近年来不断有研究发现，TanIIA对于鼻咽癌、胃癌、口腔癌、食管癌、肺癌及肝癌等细胞株具有抗癌作用[6-11]。TanIIA通过下调基质金属蛋白酶线粒体膜电位-2DNA修复酶（mitochondrial membrane potential-2 poly ADP-ribose polymerase, MMP-2PARP） 和 MMP-6明 显抑制鼻咽癌细胞系人中性粒细胞弹性蛋白酶-1D（human neutrophil elastase-1D, HNE-1D）的增殖及转移、侵袭能力[6]。TanIIA可能通过Ras/Raf/MEK/ERK通路诱导和Caspase-3表达上调，增加胃癌细胞株AGS的凋亡[7]。本研究发现TanIIA可以抑制膀胱癌细胞系T24增殖并且诱导其凋亡，其抗膀胱癌作用可能与抑制细胞周期蛋白CyclinB1，增加细胞凋亡相关基因Caspase-3有关。

CyclinB1在G2/M期起重要的调控作用，在S末期及G2早期开始合成，M期达到高峰，驱动G2期转换至M期，并与P34cdc2结合促使细胞进入有丝分裂，M后期，在Sic1作用下CyclinB1降解及P34cdc2磷酸化，使得染色体分离，有丝分裂完成[12]。G2期出现DNA损伤时抑制CyclinB1/周期蛋白依赖性激酶1（cyclin-dependent kinase 1，CDK1）活性，阻止细胞周期的进行，研究提示CylinB1的表达失调会导致恶性肿瘤的发生[13]。因此，本研究提示TanIIA可能抑制CyclinB1的过表达，使得膀胱癌T24细胞停滞在G2/M期，抑制恶性肿瘤细胞的增殖。Caspase-3作为Caspase家族蛋白成员，在细胞凋亡中起着重要作用，是执行过程的关键酶，可以被外源性或内源性路径激活，研究发现一些中草药的成份可以增加Caspase-3的表达促进肿瘤细胞的凋亡[14]。因此，类似其他研究[14]，Caspase-3的表达上调诱导T24细胞凋亡增加，可能也是TanIIA发挥抗膀胱癌作用的机制之一。

虽然，本研究提示TanIIA可能通过抑制CyclinB1和增加Caspase-3的表达发挥抗膀胱癌细胞株的作用，并且证实TanIIA具有浓度依赖性。但是对于TanIIA时间依赖性缺乏探讨，而且本研究为体外研究，若要进一步证实TanIIA的抗膀胱癌作用，则需要进一步完善膀胱癌细胞裸鼠移植瘤的体内实验，同时对于具体调控通路的研究也是今后探索方向。