TLR4受体在妊娠期缺氧子代大鼠动脉粥样硬化的研究

蒋海彬

【摘要】 目的：在妊娠期缺氧子代SD大鼠应用脂多糖，以研究TLR4受体在动脉粥样硬化中的作用。方法：将20只鼠龄8月妊娠期缺氧雄性子代大鼠分为两组（G2）和（G4），每组10只，分别给予腹腔注射生理盐水（等容积）或脂多糖（2.5 mg/kg），将20只妊娠期缺氧空白对照雄性子代大鼠（G1）和（G3）作相应处理，每周2次，连续注射8周。于12月龄后处死大鼠。采用ELISA检测大鼠血清中炎症相关因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β的水平，Real time-PCR检测大鼠主动脉组织中NF-κB p65与TLR4 mRNA表达。结果：G3和G4组炎症相关因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β水平升高（P<0.05），主动脉组织中TLR4、NF-κBp65 mRNA的表达明显升高（P<0.05），并且G4最高（P<0.05）。结论 脂多糖可以引起主动脉炎症反应。通过TLR4/NF-κB信号途径的激活，TLR4受体在动脉粥样硬化中起到了重要的作用。

【关键词】 Toll样受体4; 动脉粥样硬化; 核因子-κB; 妊娠期缺氧

【Abstract】 Objective：To investigate the pathologic mechanisms of TLR4 in atherosclerosis after TLR4 agonists（LPS）were administered to offspring rats from hypoxia during pregnancy.Method：Twenty female offspring rats from hypoxia during pregnancy aged 8 months were randomized into two groups（G2）and（G4）with 10 in each group. Saline（isovolumic normal saline）and LPS（2.5 mg/kg）were administered respectively by intraperitoneal injection，twice a week. Corresponding interventions were given to offspring rats（G1）and（G3），from control group during pregnancy and compared with offspring rats from hypoxia during pregnancy. After treatment 8 weeks，the ELISA was used to measure the IFN-γ，TNF-α，IL-1β of serologic inflammatory cytokines，and the real time-PCR was used to measure the TLR4 and NF-κB p65 mRNA expressions in aortic sinus specimens aortic sinus.Result：The levels of immune inflammatory mediators（IFN-γ，TNF-α，IL-1β）rose significantly in group G3 and G4（P<0.05）. Simultaneously，TLR4 and NF-κB p65 mRNA expressions in the aorta tissue of group G3 and G4 were enhanced（P<0.05）.In addition，the above-mentioned parameters were more obvious in group G4（P<0.05）.Conclusion：Inflammatory response occurred in the aorta tissue in rats after LPS exposure. TLR4 receptor revealed an important role in inflammatory injury of the aorta tissue after LPS stimulation by the activation of TLR4/NF-κB signal pathway.

【Key words】 Toll-like receptor 4; Atherosclerosis; Nuclear factor-kappa B; Hypoxia during pregnancy

First-authors address：NO.2 Hospital Affiliated to Xiamen Medical College，Xiamen 361000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.10.002

目前，心血管疾病等慢性病對人类健康造成了重大影响，既往大量研究表明吸烟、高血压、肥胖等为其确定的危险因素，但上述原因并不能完全解释心血管疾病的流行。有研究表明，在排除后天社会行为的因素的前提下，产前营养不良、出生体重低、产后营养状况与冠心病也存在较强的相关性[1]，上述研究表明产前与早期出生后相关因素也是心血管疾病的危险因素。作为心血管疾病的主要病理生理学基础，动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）被认为是一种“炎性疾病”。炎症伴随着AS的发展，其一个常见特征是细胞因子上调。作为一组Ⅰ型跨膜模式识别受体（transmembrane pattern-recognition receptors，PRRs）[2]，Toll样受体是（Toll-like receptors，TLRs）的特异配体包括脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）。当细胞受LPS刺激时，LPS-LPS结合蛋白（LBP）复合物结合到细胞表面CDl4/TLRs受体，通过髓样分化蛋白88（Myeloid differentiation protein 88，MyD88）依赖或非依赖MyD88信号转导途径，激活核因子-κB（Nuclear factor-kappa B，NF-κB）和活化蛋白激酶信号通路进而各种炎性细胞因子基因表达上调[3-4]，炎性介质水平上调[5-6]。本研究旨在通过对妊娠期缺氧子代Sprague-Dawley（SD）大鼠腹腔注射LPS，观察血中炎症因子[主要包括白介素IL-1β（interleukin1 IL-1β）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）和干扰素-（Interferon-γ，IFN-γ）]、TLR4及下游NF-B在主动脉中的表达，以研究LR4受体在AS中的作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 建立动物模型

1.1.1 对象 健康清洁级雄性SD大鼠24只（16周龄，体重360～400 g），健康清洁级雌性SD大鼠24只（12周龄，体重200～250 g），均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。将雄雌大鼠按1：1比例随机合笼，妊娠期缺氧及空白对照下所孕育子代SD雄性大鼠。

1.1.2 实验设计 本研究的研究因素是妊娠期缺氧和子代大鼠成年后腹腔注射LPS，研究其对AS的影响。实验采用完全随机分组的两因素两水平析因设计，子代雄性大鼠共分四组，正常组（G1）、妊娠期缺氧组（G2）、腹腔注射内毒素组（G3）和妊娠期缺氧再腹腔注射内毒素组（G4），每组10只，窝别、鼠龄、体重、动物饲养等因素匹配。

1.1.3 实验方法

1.1.3.1 建立妊娠期缺氧模型 将雄雌大鼠按1︰1比例随机合笼，采用托盘法每半天检查1次是否有阴栓，发现阴栓为妊娠第0天。然后将妊娠大鼠随机分为两组，即分别于妊娠第1天开始缺氧和空白对照组，每组各6只。将妊娠大鼠分批置入缺氧箱内，氮气和氧气分别通过四个进气孔通入（每种两孔），内置小电扇将输入的气体不断混匀，出气通路使用单向活瓣，箱内外大气压通过箱体预留小缝隙与箱外大气相通从而保持平衡。同时在箱内放置碱石灰和氯化钙（用于吸收CO2和水蒸气）。维持箱内温度19～23 ℃，湿度64%～68%，CO2浓度<3%，将箱内氧气浓度控制于（10±1）%（通过S-450型氧气检测报警仪监测以实时调节氮气和氧气的流量）。于箱体内处理3 h后取出动物，每天重复上述过程直至大鼠分娩。對照组孕鼠置于同样的缺氧箱内，持续通入空气，保持箱内与箱外氧浓度一致，处理时间与缺氧组相同。

1.1.3.2 建立腹腔注射内毒素动物模型 对鼠龄、窝别、体重等因素进行匹配后，随机取上述孕鼠子代雄性大鼠，体重300～350 g，鼠龄8月，共分四组，正常组（G1）、妊娠期缺氧组（G2）、腹腔注射内毒素组（G3）和妊娠期缺氧再腹腔注射内毒素组（G4），每组10只。将 20只鼠龄8月妊娠期缺氧雄性子代大鼠分为两组（G2）和（G4），分别给予腹腔注射生理盐水（等容积）或脂多糖（2.5 mg/kg，250 μg/mL）（sigma公司，美国），将20只妊娠期缺氧空白对照雄性子代大鼠（G1）和（G3）进行相应处理并做比较，每周两次，连续注射8周。在相同条件下饲养，共持续8周，喂养至12月龄。大鼠的饲养及处理经过福建医科大学动物关怀与应用委员会的批准。

1.2 留取大鼠血及组织标本 于12月龄，腹腔注射3%戊巴比妥钠（30～45 mg/kg）麻醉后，分离腹主动脉，插管采集血液标本，测相关指标。截取整段胸腹主动脉，置于冻存管中液氮中速冻，转入-80 ℃冰箱待测。

1.3 ELISA检测IFN-γ、TNF-α、IL-1β水平应用ELISA试剂盒干扰素-（IFN-γ，上海科顺生物科技有限公司）、肿瘤坏死因子（TNF-α，南京森贝伽生物科技有限公司）和白介素IL-1β（IL-1β，上海远慕生物科技有限公司）检测血清IFN-γ、TNF-α、IL-1β的水平。

1.4 实时PCR检测TLR4、NF-κB p65的mRNA水平 主动脉组织提取总RNA。根据cDNA合成试剂盒将5 μg总RNA逆转录为cDNA（Takara公司，日本）。使用实时PCR试剂盒（Takara公司，日本）进行扩增，实时PCR反应体积20 μL，其中cDNA2 μL，上下游引物各0.4 μL，实时PCR试剂10 μL，去离子水7.2 μL，阴性对照组以双蒸水代替模板。标准曲线内参为GAPDH。引物序列：TLR4上游引物（5-ATGTTGTGGCTACTATAGGC-3）、下游引物（5-GGCCACTTTCGTGACTTCGAA-3）;NF-κB p65上游引物（5-TCCTTCTCGCGTGACAATCGA-3）、下游引物（5-ATTGGATCTAAGG GATCACGC-3）;内参GADPH上游引物（5-AGACTGTCGTCCGTGGA CTCG-3）、下游引物（5-TGGGGCCAGAGAGGTCATTCCCA-3）。PCR反应条件：95 ℃ 30 s，循环1次;变性95 ℃ 5 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，循环共40次;65 ℃ 10 s，循环1次。

1.4 统计学处理 采用SPSS 23.0统计软件进行处理，血炎性因子与主脉组织内mRNA表达等定量数据以（x±s）表示，采用单因素方差分析进行比较，多重比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各大鼠一般情况及主动脉切片情况 妊娠期缺氧组出现出生低体重后追赶生长，至5月龄时，体重已无区别。注射生理盐水的各对照组大鼠饮食与活动良好，无意外及死亡，毛发光滑;注射LPS组大鼠未出现死亡，但活动明显迟滞，毛发紊乱、精神萎靡。对实验对象主动脉根进行切片染色显示，只有妊娠期缺氧子代大鼠LPS组主动脉根部内膜增厚，部分斑块形成，不同程度的炎细胞浸润于血管外膜。

2.2 各组血清IFN-γ、TNF-α、IL-1β浓度比较 ELISA检测结果显示，经LPS作用后，G3和G4组IFN-γ、TNF-α、IL-1β表达水平血清水平较盐水组明显升高（P<0.05），且妊娠期缺氧注射LPS（G4）组最高（P<0.05）。见表1。

2.3 主动脉组织TLR4和NF-κB p65 mRNA的表达水平 实时定量PCR检测结果显示，经LPS作用后，G3和G4组TLR4和NF-κB p65 mRNA表达水平较盐水组明显升高（P<0.05），且妊娠期缺氧注射LPS（G4）组最高（P<0.05）。见表2。

3 讨论

AS是一种“炎症性疾病”，血管内膜炎性损伤及修复参与了AS的形成过程。体内多种细胞通过相关因子相互作用，促进了AS的发生发展，TLRs在其中起着重要作用。机体可通过免疫细胞表面的TLR识别病原相关分子模式（主要包括LPS和脂磷壁酸、膜脂蛋白、糖脂肽和某些病毒DNA等）。TLRs与配体结合后通过信号转导途径激活NF-κB，影响细胞因子的合成与释放，促进或抑制炎症。TLR4特异性地识别LPS，是LPS诱发炎性反应的关键[7]，是LPS激活NF-κB的上游机制[8]，能够持续诱导NF-κB的活性，上调炎症因子，介导诱发炎性反应[9-10]。LPS可直接作用于TLR4受体，上调其表达[11]，也可作用于细胞表面的CD14，通过LPS/CD14复合物[12]，上调TLR4受体的表达，其表达量与促炎性介质的释放量有关[13]。TLR4表达上调可大量激活NF-κB，NF-κB即可由胞质进入细胞核，启动多种细胞因子（如IFN-γ、TNF-α、IL-1β）基因的转录和翻译，从而诱导炎性细胞激活[14]。

慢性心血管疾病病理生理过程中存在性别差异，雌性可能存在保护作用，故本研究中把研究对象设为雄性子代大鼠。妊娠期缺氧与子代出生低体重有关，在本研究中也得以体现。当条件恢复后生长抑制大鼠出现追赶生长（代偿性的快速生长）。本研究妊娠期缺氧组3月龄前的追赶生长比较明显，至5月龄时，体重已无差别。本研究结果中，经LPS作用后，G3和G4组主动脉组织TLR4和NF-κB p65 mRNA及血清学IFN-γ、TNF-α和IL-1β 表达水平较盐水组明显升高（P<0.05）;且宫内缺氧LPS组G4最高（P<0.05），证明LPS能够刺激主动脉组织等细胞TLR4，进而激活NF-κB信号通路，启动IFN-γ、TNF-α和IL-1β细胞因子基因转录，从而诱导炎性细胞激活同时，展示了TLR4通路介导的炎症损伤，提示脂多糖在妊娠期缺氧模型中较容易诱导AS，表明妊娠期缺氧是AS的危险因素，但不一定单独致病，而是在后天环境刺激过程中得以体现。TLR4通路在AS与宫内缺氧的关系中可能起到了桥梁及加速的作用。LPS引起的人类血管外膜成纤维细胞的脂质沉积主要是通过TLR4/NF-κB通路实现[15]。TNF-α通过激活NF-B信号通路在AS中起作用。细胞中的NF-κB在未受到活化时不具有相关功能。此时，被结合的NF-κB P65亚基覆盖P50亚基的核定位信号，蛋白复合体被“囚禁”在细胞质中，转录调节作用无法发挥[16]。当细胞受到LPS等细胞外信号刺激时，蛋白激酶被激活，致使结合在NF-κB P65亚基上的蛋白N端调节区Ser32/36磷酸化，然后该区内的两个赖氨酸残基结合泛素蛋白，受蛋白酶小体的作用而裂解，NF-κB獲得了自由，迅速从细胞质转移至细胞核[17]。在体内，NF-κB的活化过程受到精细调控，会与其他炎症信号转导通路有交汇作用，其主要的调节方式为反馈调控。具体有两种调节途径：（1）正反馈调节（细胞内），TNF-α和IL-1β转录基因受活化后的NF-κB增强，从而释放大量TNF-α和IL-1β，最后NF-κB被激活;（2）负反馈调节（细胞内外），在胞内，NF-κB可特异识别其抑制蛋白基因顺式作用元件，调控其抑制蛋白转录，NF-κB活化后，其抑制蛋白转录亦被上调，在胞外，负向调节细胞因子IL-10受LPS、TNF-α和IL-1β的刺激而大量出现，然后内毒素诱导的NF-κB活化被IL-10阻断，促炎细胞因子受到抑制，急性炎症反应中断[18-20]。本研究中，妊娠期缺氧在追赶生长中，可能存在炎症反应及其正反馈调节，而在受到LPS刺激后，易受激发。

本研究腹腔内注射LPS致AS发病过程中，LPS通过TLR4/NF-κB 途径引起血管炎症反应，即激活TLR4，活化NF-κB ，诱发炎性因子，趋化炎性细胞至血管内皮下，最终导致AS的形成和发展，为AS始于血管内皮损伤之学说提供佐证，在跨膜信号转导通路的“源头”水平上进一步认识AS发病机制。AS的形成和发展中，各种交汇作用非常广泛和复杂，并且不同的细胞和不同的状态时效应有所不同，其精确的相互作用及调控机制仍然是重要的研究方向。

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