Bouin氏液二次固定时间对家兔肝脏纤维化Masson三色染色的影响

徐艳　王玲　董洋　郭冬梅　李延辉

【摘要】 目的：探讨Bouin氏液二次固定时间对Masson三色染色效果的影响，进一步寻找Bouin氏液二次固定的最佳条件。方法：取5例肝纤维化模型家兔肝脏组织（10%中性福尔马林固定）的蜡块，切片、脱蜡后，用Bouin氏液二次固定，固定时间分别为0 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、过夜。进行Masson三色染色并用光镜和统计软件分析比较染色结果。结果：未经二次固定的切片与所有经过二次固定的切片染色评分比较，差异均有统计学意义（P<0.05）;二次固定过夜的染色效果最好，其与二次固定4 h染色评分比较，差异无统计意义（P>0.05）。结论：Bouin氏液二次固定的肝纤维化切片的Masson三色染色效果优于仅经福尔马林固定的切片;二次固定4 h或过夜切片的染色效果最佳。

【关键词】 Bouin氏液; 10%中性福尔马林; Masson三色染色; 肝纤维化

【Abstract】 Objective：To evaluate the results of Massons tri-colour staining at different times of re-fixation the paraffin fixation sections in Bouins solution，searching for the best condition for re-fixation in Bouins solution.Method：The wax block of 5 liver fibrosis model rabbit liver tissue（10% neutral Formalin fixation）was taken.Bouins solution was used to re-fixation the paraffin fixed sections after slicing and dewaxing.The re-fixation time were 0 min，15 min，30 min，1 h，2 h，4 h，all night long.Proceeding Massons tri-color staining.The staining results with light microscopy and statistical software were compared.Result：There were statistically significant differences in taining scores between re-fixation sections and the Paraffin fixed sections（P<0.05）.Among all the groups，the group whose re-fixation time of all night long had the best staining effect，and it had no statistically significant difference with the group whose re-fixation time of 4 h（P>0.05）.Conclusion：Massons tri-colour staining of liver fibrosis sections fixed with Bouins solution twice was better than that of fixation with Formalin only.

【Key words】 Bouins solution; 10% moderate Formalin; Massons tri-colour staining; Liver fibrosis

First-authors address：Dalian Jinzhou First Peoples Hospital，Dalian 116100，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.12.006

Masson三色染色（以下簡称Masson染色）是一种经典的特殊染色方法，可以显示细胞核、细胞质和细胞外胶原三种组织结构[1]，尤其易于观察胶原纤维的空间结构[2]，可以弥补在HE染色中被染成淡粉色而与肌纤维等成分难以区分的不足，但因该染色操作繁琐、对组织固定要求高等问题一直未能在常规病理诊断中得到普及应用。研究显示Bouin氏液固定组织Masson染色效果优于病理科最常用的组织固定剂——10%中性福尔马林[3-6]。有研究报道，经甲醛固定的组织如果要获得满意的Masson染色效果，必须再经过第二次固定[7]。本实验试探讨福尔马林固定的石蜡组织使用Bouin氏液二次固定的时间对Masson染色效果的影响，进一步寻找Bouin氏液二次固定的最佳条件。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 收集四氯化碳诱导肝纤维化模型家兔肝组织蜡块，由大连医科大学附属第二医院郭冬梅课题组提供。所有标本在离体后均经10%中性福尔马林固定;所有蜡块切片均已进行Batts-Ludwig肝纤维化分期[6]，从0～4期（F0～F4期）肝纤维化组织蜡块中各随机挑选1例（共计5例）纳入本实验。

1.2 主要试剂与仪器 Bouin氏液（1.22%苦味酸饱和液、甲醛、冰醋酸按15︰5︰1的比例混合），购自北京华越洋生物科技有限公司;Masson染色试剂套装，包括Weigert铁苏木素A液（主要含苏木素）、Weigert铁苏木素B液（主要含三氯化铁水溶液）、丽春红酸性品红染液、磷钼酸溶液、苯胺蓝染液，购自珠海贝索生物技术有限公司;甲醛溶液、无水酒精、二甲苯，均为分析纯，均购自天津市大茂化学试剂厂;冰醋酸，分析纯，购自西陇科学股份有限公司。所需仪器主要有Thermo HM340E切片机、亚光生物组织摊拷片机、恒宇电热恒温箱、OLYMPUS BX43光学显微镜。

1.3 切片与分组 本实验依二次固定时间的不同分为A、B、C、D、E、F、G组，分别进行染色，其中A组不进行二次固定，B～G组均采用Bouin氏液进行二次固定，固定温度37 ℃，固定时间：B组15 min、C组30 min、D组1 h、E组2 h、F组4 h、G组过夜。每例蠟块连续切7张3.5 μm厚白片且均按照A～F顺序编号（共计35张），60 ℃烤片1 h备用。

1.4 方法与步骤 （1）脱蜡：二甲苯60 ℃ 0.5 h两次，无水酒精10 min两次，95%酒精10 min两次，75%酒精10 min两次后至水;（2）二次固定（具体见“分组”，A组跳过此步），流水冲洗至黄色褪尽（约10 min）;（3）媒染：Weigert铁苏木素A、B混合液滴染10 min，自来水稍洗;（4）分化返蓝：1%盐酸酒精数秒，自来水冲洗10 min，蒸馏水稍洗;（5）丽春红酸性品红溶液滴染10 min，蒸馏水洗稍洗;（6）磷钼酸溶液滴染3 min，倾去;（7）苯胺蓝溶液滴染3 min，倾去;（8）1%冰醋酸溶液涮洗至无蓝色脱出;（9）脱水、透明：95%酒精稍洗两次，无水酒精10 min两次，二甲苯10 min两次;（10）中性树胶封固。本实验共分7次完成（每次进行一组），每组实验除二次固定时间不同外，其余实验条件及步骤均严格统一标准化进行。

1.5 染色评分 光镜下每张切片随机选取5个低倍视野，分别对A～G组35张切片的Masson染色情况进行评估。本实验Masson染色质量评估参考李金龙等[8]的方法从胶原纤维、细胞质、核质分明程度以及细胞核分辨率四个方面分别进行评估，具体评估标准：胶原纤维（不着色0分、着色不均匀或有晕1分、着色均匀且中等强度2分、着色均匀且高强度3分）、细胞质（不着色0分、着色不均匀1分、着色均匀且中等强度2分、着色均匀且高强度3分）、核质分明（无0分、弱1分、中等2分、强3分）、核分辨率（无0分、低1分、中等2分、高3分）。参照Metgud等[9]的方法，本次评分总得分范围为0～12分（0～4分表示染色效果不满意、5～7分表示染色可以满足诊断但效果一般、8～12分表示染色可以满足诊断且效果较好）。采用单盲评分，由本科一名资深的主任医师完成。

1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，多组间比较采用方差分析。并用Graph Pad Prism 5.0进行作图分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

肉眼观察G、F、E、D、C、B、A组中的肝组织切片，颜色由紫红色到紫黑色逐渐加深。光镜下，G组切片中胶原纤维染成蓝色，肝细胞浆、平滑肌肌纤维等胞质以及红细胞染成不同程度的红色，胞核染成黑褐色，核质分明，颜色鲜丽，对比度清晰，F组的情况与之相仿;E、D、C、B、A组切片光镜下依次显示背景染色逐渐加深;A组中肝细胞浆呈深紫红色，与肝细胞核辨别困难，在其背景上的胶原纤维不易识别;0期纤维化肝组织的胶原纤维在各组中着色普遍较淡，A～E组内新形成的细丝状胶原纤维边缘均可见晕染;F和G组相对染色效果较好，胶原纤维、细胞质、细胞核以及核浆对比度均显色较清晰。

本实验各组5例不同程度的纤维化肝组织Masson染色评分显示，D、E、G、F四组的染色评分均值都在7分以上，可以满足诊断需要;而A、B、C三组的染色评分中均有低于5分者，属染色效果不满意。经方差分析结果显示，组间差异有统计学意义（F=31.476，P=0.000）;进一步各组两两比较显示，A组与其余B～G组的染色评分比较差异均有统计学意义（P=0.000）;G组分别与B、C、D、E组评分比较差异均有统计学意义（P=0.000、0.000、0.000、0.005）;F组分别与B、C、D组评分比较差异均有统计学意义（P=0.000、0.000、0.017）;E组分别与B、C组评分比较差异均有统计学意义（P=0.000）;D组分别与B、C组评分比较差异也均有统计学意义（P=0.004、0.012）;B组与C组、D组与E组、E组与F组、F组与G组的评分比较差异均无统计学意义（P=0.688、0.181、0.284、0.083）。见表1。提示二次固定实验组中，G组的染色效果最好，其与F组的染色效果相当;E组和D组的染色效果居中，且两者的染色效果相当;B组和C组的染色效果最弱，且两者染色效果相当。进一步采用GraphPad Prism 5.0对各组中不同程度纤维化肝组织染色评分的均值进行分析，得出不同程度纤维化肝组织在不同二次固定时间下Masson染色评分均值分布情况。0～4期的肝纤维化组织在D、E、F、G组的染色效果明显优于A、B、C组，其中G组的染色效果最好，F组与其评分比较差异无统计学意义（P>0.05），见图1。

3 讨论

3.1 Bouin氏液在Masson染色中的优势 本实验结果显示，纤维化肝组织Masson染色效果与二次固定的条件及时间差异有关（P=0.000），所有经Bouin氏液二次固定后的纤维化肝组织Masson染色效果均明显优于仅经甲醛固定后的组织（P=0.000），此结果与陈余朋等[10]的研究结果相似。本实验所用的Masson染色法是联合使用媒染剂（铁、钼）和分子量大小不同的染料（苯胺蓝、丽春红、酸性品红等）选择性的作用于胶原纤维、肌纤维、细胞质、红细胞以及细胞核，使其显示不同程度的蓝、红、黑褐等三种色系。赵荧等[11]认为固定后的组织因其蛋白质暴露于固定剂，结构链与之发生作用形成蛋白质“网络”，这些“网络”因其孔隙大小和数量的不同而具有不同特征;染色时分子量不同的染料对组织结构的选择性作用以及组织内部因固定所形成的结构（即“网络”）变化便决定了Masson染色的成败;小的染料分子可浸透至小（如红细胞）、中（如肌纤维、细胞质）、大（如胶原纤维）三种“网络”内;中等大的染料分子可置换出位于中、大“网络”内的小染料分子而着色;大分子染料则可置换出位于大“网络”中的中、小染料分子进行着色。因此，使用有利于形成大、中、小“网络”的组织固定剂是做好Masson染色的关键。Bouin氏液是一种包括苦味酸、甲醛和冰醋酸的混合固定液，其中冰醋酸能使组织胶原纤维膨胀[12]，其与苦味酸配伍能抑制苦味酸对胶原纤维的收缩[13]，这种固定液穿透力均匀且迅速、组织收缩不明显[14-15];而福尔马林固定液成分则相对单一，无法像Bouin氏液一样做到对组织内在结构膨胀与收缩不同层次的细微调整。

3.2 最佳的二次固定时间 本实验中，光镜下纤维化肝组织Masson染色效果的好坏主要表现在新形成的细丝状胶原纤维边缘的晕染以及胶原纤维与背景组织着色的对比度上。研究表明，固定时间不足、完全渗入细胞内的固定液不足，导致细胞成分固定不均匀[16]，影响染色效果。本实验结果显示在所有二次固定的纤维化肝组织中，过夜的染色效果最好，4 h次之，2、1 h居中，30、15min最差;其中，二次固定过夜与4 h的染色效果均能达到较好的程度，日常工作中在保证染色质量不影响诊断的条件下，F组相比G组制片所需时间更短，效率更高，更符合工作要求。

3.3 Masson染色的其他影响因素 依本次实验所得经验，除固定液外，Masson染色过程中还需注意以下问题：（1）切片脱蜡彻底。保持脱蜡剂的浓度，做到及时更换，可避免因脱蜡不足造成的组织与染料无法充分结合而有模糊不清的表现。本实验采用60 ℃二甲苯脱蜡，可快速彻底地将石蜡脱干净。（2）褪黄彻底：切片在经Bouin氏液固定后，务必将固定液洗净后再进行后续染色。（3）Weigert铁苏木素A、B液即用即配：因为铁与染色剂的色素根化合后会形成不溶性沉淀而不能在配置后长期放置。（4）光镜下调整磷钼酸的分化程度：当红染的胶原纤维变淡，区别于肌纤维时即可终止分化——此步骤很关键[17]，因为磷钼酸既是分化剂也是胶原纤维的特异性媒染剂，在分化时它选择性作用于胶原纤维，使其释放已结合的中分子染料（呈淡红色），而后与大分子染色剂苯胺蓝相结合形成复合物，牢固地附着于胶原纤维上（显蓝色）。（5）冰醋酸溶液与95%酒精均有一定的脱色性，浸洗时不可时间过长，否则会引起褪色而影响染色效果[18]。

本实验中，二次固定1、2 h的纤维化肝组织的染色效果虽然也可以满足诊断需要，但是与4 h和过夜的染色效果相比还有一定差距。笔者认为倘若适当提高二次固定的温度，固定液渗透速度加快，或许会改善这两组的染色效果，这一假设尚有待进一步实验证实。

综上所述，Bouin氏液二次固定的肝组织切片进行Masson染色确定可以达到满意效果，以过夜和4 h的染色效果为最佳。满意的Masson染色既能显示波浪状分布的成熟纤维束，也能清晰显示较难识别细丝状的新生胶原纤维，现多用于评估肝穿、肾穿组织炎症时的修复情况和纤维化程度[19-20]，极具应用价值。经济又有效的Bouin氏液二次固定无疑能为只有甲醛固定标本的基层医院病理科开展Masson染色解决标本固定的难题，值得临床推广。

参考文献

[1] Rosai J.ROSAI & ACKERMAN外科病理学（上卷）[M].郑杰，译.10版.北京：北京大学医学出版社，2014：39.

[2] Martinello T，Pascoli F，Caporale G，et al.Might the Masson trichrome stain be considered a useful method for categorizing experimental tendon lesions？[J].Histol Histopathol，2015，30（8）：963-969.

[3]黄利，秦魏笈，华晓萍.Bouin氏液与10%福尔马林固定组织对Masson氏三色染法染色结果的影响[J].中药药理与临床，2016，32（2）：230-232.

[4]房爱菊，甄军晖，程凤凤.不同固定液对肾穿刺活检组织固定及染色差异的比较[J].实验与临床病理学杂志，2014，30（11）：1309-1310.

[5]平国强，唐锦玲，杨春青.改良Masson三色染色法在应用中的体会[J].实用医技杂志，2014，21（6）：603.

[6]郭伟，姜玉新.两种固定液对肺组织固定效果的比较[J].皖南医学院学报，2014，33（2）：99-101.

[7] John D.Bancroft Alan Stevens.组织病理学染色法及其在诊断上的应用[M].北京：北京首都医院病理科译，1978：67.

[8]李金龙，陈婷婷，王高飞，等.基于常规HE染色的组织最佳核染时间探索[J].临床与实验病理学杂志，2018，34（6）：697-699.

[9] Metgud R，Astekar M S，Soni A，et al.Conventional xylene and xy-lene-free methods for routine histopathological preparation of tissuesections[J].Biotech Histochem，2013，88（5）：235-241.

[10]陈余朋，张声，陶璇，等.肾穿刺活检组织Masson染色的改良[J].诊断病理学杂志，2016，23（3）：235-236.

[11]赵荧，唐军民.形态学实验技术[M].北京：北京大学医学出版社，2008：127-128.

[12]赵玉琼，李瑞生，陈华.三种固定液对大、小鼠肠道组织石蜡切片质量的影响[J].中国比较医学杂志，2014，33（11）：53-56.

[13]罗灿峤，莫木琼，聂钊铭，等.比较5种混合固定液对小鼠眼球标本制片质量和染色效果的影响[J].中国卫生检验杂志，2015，25（13）：2065-2067.

[14]王蕾，刘亚萍，陈静.卵巢切片制作方法体会[J].实用医技杂志，2014，24（9）：978-980.

[15]魏胜男，曾翔俊，李汇华.小鼠肾脏纤维化Masson染色方法的改进[J].解剖学报，2013，44（4）：576-579.

[16]刘天雪，付新录，梁十，等.不同固定液和时间对大鼠睾丸组织病理学制片质量的影响[J].药物评价研究，2016，39（1）：83-86.

[17]李和，周莉.组织化学与细胞化学技术[M].北京：人民卫生出版社，2014：41-42.

[18]韩福兰，毛荣军，谢乐.冰冻切片组织固定及染色的温度调控对制片质量的影响[J].国际医药卫生导报，2015，21（12）：1652-1654.

[19]邹万忠.肾活检病理学[M].北京：北京大學医学出版社，2014：25-26.

[20] Howard Thomas，Stanley Lemon，Arie Zuckeman.病毒性肝炎[M].牛俊奇，译.3版.天津：天津科技翻译出版有限公司，2013：723-735.

（收稿日期：2018-11-07） （本文编辑：程旭然）