不同证型代谢综合征与CDKAL1、PPARG基因的关系分析

2019-08-19 01:33康洁丁珊珊张凌媛沈建英
中国医学创新 2019年12期
关键词:证型综合征基因

康洁 丁珊珊 张凌媛 沈建英

【摘要】 目的:探讨代谢综合征(MS)中痰湿壅盛、气阴两虚证型与CDKAL1、PPARG基因的关系。方法:选取60例MS患者,按照证型将其分为痰湿壅盛组、气阴两虚组,各30例,同时选取健康人群30例为对照组;采用实时荧光定量PCR(Q PCR)技术检测CDKAL1、PPARG基因,分析CDKAL1、PPARG基因与两种证型的相关关系。结果:痰湿壅盛、气阴两虚组CDKAL1、PPARG基因表达均高于对照组(P<0.000 1),且气阴两虚组CDKAL1基因表达高于痰湿壅盛组(P<0.05);气阴两虚组PPARG基因表达高于痰湿瘀滞组,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论:MS患者CDKAL1、PPARG基因表達均上调,与不同证型-痰湿壅盛与气阴两虚表达均呈一定的相关关系。

【关键词】 代谢综合征; 证型; 细胞周期素依赖性激酶5调节亚单位相关蛋白1类似物1; 过氧化物酶体增生激活受体γ

【Abstract】 Objective:To explore the relationship between the syndrome of accumulation of phlegm dampness and deficiency of both vital energy and yin in metabolic syndrome(MS)and CDKAL1 and PPARG genes.Method:60 MS patients were selected,according to syndrome types,they were divided into accumulation of phlegm dampness group and deficiency of both vital energy and yin group,30 cases in each group,at the same time,30 healthy people were selected as control group.CDKAL1 and PPARG genes were detected by real-time fluorescence quantitative PCR(Q PCR),and the correlation between CDKAL1 and PPARG genes and the two syndromes was analyzed.Result:The expression of CDKAL1 and PPARG gene in accumulation of phlegm dampness group and deficiency of both vital energy and yin group were higher than those of control group(P<0.000 1),and the expression of CDKAL1 gene in deficiency of both vital energy and yin group was higher than that of accumulation of phlegm dampness group(P<0.05),the expression of PPARG gene in deficiency of both vital energy and yin group was higher than that of accumulation of phlegm dampness group,but the difference was not statistically significant(P>0.05).Conclusion:The expression of CDKAL1 and PPARG genes were up-regulated in MS patients,which were correlated with different syndromes-accumulation of phlegm dampness and deficiency of both vital energy and yin.

【Key words】 Metabolic syndrome; Syndrome type; CDKLA1; PPARG

First-authors address:Fujian University of TCM,Fuzhou 350122,China

doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2019.12.002

代谢综合征(metabolic syndrome,MS)是指受遗传与环境因素影响,人体的蛋白质、脂肪、碳水化合物等物质发生代谢紊乱的病理状态,是一组复杂的代谢紊乱症候群,是导致糖尿病、心脑血管疾病的危险因素。MS不仅仅是单一的一种疾病,而是多种疾病综合在一起的表现。MS在祖国医学中,并无明确的记载,根据其临床特征,应归属于中医病证“眩晕”“湿阻”“消渴”“肥满”“头痛”等范畴。现代中医学者认为MS的病因病机是先天禀赋不足、嗜食肥甘、静坐少动、忧思郁怒等导致脾失健运,肾失蒸腾,肝郁气滞,产生痰浊、水湿、瘀血、热毒等[1-2]。现代研究表明,糖尿病人群、MS等糖耐量受损人群等均与细胞周期素依赖性激酶5(CDK5)调节亚单位相关蛋白1类似物1(CDKAL1)基因、过氧化物酶体增生激活受体γ(PPARG)编码基因的调节有关。本研究选取60例MS患者,按证型分为痰湿壅盛、气阴两虚两组,探讨CDKAL1与PPARG基因与痰湿瘀滞、气阴两虚MS患者的关系。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年1-6月福建中医药大学附属晋江中医院体检筛查MS患者60例为试验组,选取同期体检健康者30例为对照组。MS的诊断采用2005年国际糖尿病联盟(IDF)诊断标准:(1)中心性肥胖(中国男性腰围≥90 cm,女性腰围≥80 cm);(2)合并以下4项指标中任2项:①甘油三酯(TG)水平升高,>150 mg/dL(1.7 mmol/L),或已接受相应治疗;②高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)水平降低,男性<40 mg/dL(0.9 mmol/L),女性<50 mg/dL(1.1 mmol/L),或已接受相应治疗;③血压升高:收缩压≥130 mm Hg或舒张压≥85 mm Hg,或已接受相应治疗或此前已诊断高血压;④空腹血糖(FPG)升高,FPG≥100 mg/dL(5.6 mmol/L),或此前已诊断2型糖尿病或已接受相应治疗。纳入标准:年龄60~65岁,性别不限;符合MS诊断标准。排除标准:患有严重的糖尿病、高血脂、高血压、冠心病、脑血管病;慢性感染史及恶性肿瘤;有明显的血常规、血生化及肝肾功能异常。按照证型将试验组随机分为痰湿壅盛组、气阴两虚组,各30例。研究对象均对本研究知情同意。

1.2 方法

1.2.1 四诊材料收集 参照2002年《中药新药临床研究指导原则(试行)》[3],2名合格的中医专业人员经过严格培训,按规范的方法负责收集中医四诊资料,将符合MS标准且诊断为痰湿瘀滞、气阴两虚两类证型的患者纳入研究。

1.2.2 血液采集 空腹至少8 h后于清晨采集患者外周血,用于检测CDKAL1与PPARG基因的表达。

1.2.3 CDKAL1与PPARG基因检测 空腹时,采集患者的静脉血1 mL,用中量全血基因组RNA提取试剂盒提取外周血白细胞RNA,测定RNA的浓度和纯度;将OD260/OD280值在1.8~2.0的RNA反转录成cDNA,测定cDNA的浓度和纯度,-80 ℃保存备用;采用Real-Time qQPCR法进行检测。(1)主要试剂:全基因组RNA提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司;SYBR Green Master mix购自TaKaRa公司;反转录试剂盒购自Toyobo公司;其他化学试剂均为国产分析纯。(2)主要仪器:台式冷冻离心机(德国Eppendorf 5415R);超微量紫外分光光度计(美国Thermo Nano Drop 2000);超低温冰箱(美国Thermo U570);梯度PCR扩增仪(美国ABI Veriti TM);荧光定量PCR仪(德国Eppendorf Mastercycler)。(3)引物的设计与合成:CDKAL1与PPARG和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的引物序列由上海生工生物技术公司设计并合成,详细序列见表1。(4)RNA的提取与cDNA的合成:RNA的提取参照全血基因组RNA提取试剂盒说明书进行;紫外分光光度计定量,并鉴定RNA的纯度;cDNA的合成参照反转录试剂盒说明书进行。反应体系:RNA 2 μg,65 ℃ 5 min变性后,立即置于冰上冷却,再加入5×RT Master Mix 4 μL,最后加Nuclease-free Water至终体积20 μL。PCR仪反应条件:37 ℃ 15 min,52 ℃ 5 min,98 ℃ 5 min。-20 ℃保存备用。(5)实时荧光定量RT-PCR扩增:采用SYBR GreenⅠ法,参照SYBR Master Mix试剂盒说明书进行,以GAPDH为内参基因,每个样本的CDKAL1与PPARG基因和内参GAPDH基因扩增各重复3次。反应体系:cDNA 2 μL,SYBR Master Mix 12.5 μL,上游引物及下游引物各1 μL,RNase-free Water 8.5 μL,共计25 μL。反应条件:预变性95 ℃ 30 s,PCR反应95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,68 ℃ 30 s,40个循环;溶解曲线生成的反应程序:95 ℃ 15 s,60℃ 15 s,95 ℃ 15 s。得出各反应扩增曲线和Ct值,以2-△△Ct表示试验组中目的基因的表达相对于对照组的变化倍数,其中△△Ct=(Ct目的基因-Ct内参基因)试验组-(Ct目的基因-Ct内参基因)对照组。

1.3 统计学处理 使用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析,计量资料用(x±s)表示,组间比较采用t检验;计数资料以率(%)表示,比较采用字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组基线资料比较 对照组男14例、女16例,年龄(63.70±1.12)岁;痰湿壅盛组男17例、女13例,年龄(62.33±1.57)岁;气阴两虚组男15例、女15例,年龄(62.98±1.65)岁。三组一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

2.2 各组CDKAL1、PPARG基因表达比较 痰湿壅盛、气阴两虚组CDKAL1、PPARG基因表达均高于对照组(P<0.000 1),且气阴两虚组CDKAL1基因表达高于痰湿壅盛组(t=2.72,P=0.01);气阴两虚组PPARG基因表达高于痰湿瘀滞组,但差异无统计学意义(P>0.05),见表2和图1。

3 讨论

MS在传统医学中并无相关记载,也没有统一的辨证分型标准,与“肥胖”“历节”“消渴”等疾病相关。《素问》中提到:“年四十,而阴气自半,起居衰矣。”阐释了随着年龄增长,壮年过后身体气血衰弱、气运血行逐渐衰退,导致津液流通不畅,从而产生痰浊血瘀等病理产物的变化过程[4]。现代医学认为MS是以胰岛素抵抗为基础[5],临床表现为中心性肥胖,并出现以高血压、脂质代谢紊乱、糖代谢异常等聚集出现为特点的一组临床症候群[6]。刘才华等[7]研究表明,代谢综合征与体质指数、肥胖、血压等密切相关,这与本研究所选择的此类疾病高发人群作为研究对象相符合,而在治疗方面,中医学以整体观念为指导,在本病的防治方面积累了丰富的经验,显示出整体调节、防治并重、副作用少等独特的优势,因而备受青睐。对中医证型与基因蛋白表达的关系进行研究,可以为临床辨证论治提供分子生物学依据。

CDKAL1基因位于人类染色体6p22.3,是编码含539个氨基酸残基的蛋白,在人类胰腺、骨骼肌细胞及脑组织中高度表达[8]。PPARG基因定位于3p25,属于转录因子的核激素受体超家族,在调节胰岛素灵敏性、脂肪细胞的分化及脂肪细胞特异基因的表达方面表现出重要的作用,可能参与MS的发生发展[9]。CDKAL1、PPARG基因可以使胰岛细胞功能受损。多项研究表明,在健康人群、糖尿病人群、糖耐量受损人群,CDKAL1、PPARG不同的单核苷酸多态性(SNPs)都与胰岛素的分泌量有关,在MS发生发展中均发挥着重要的作用。

该病病性本虚标实,本虚则見气虚、阴虚,标实以痰浊、瘀血、热郁为主,多累及肝、脾、肾三脏。研究发现,痰湿壅盛、气阴两虚是MS患者中常见的两组证型[10]。同时,已有大量研究资料显示MS与痰湿壅盛、气阴两虚存在密切关系[11-13]。肥胖体型多与气虚、阳虚、痰湿、湿热等证候相关[14],而痰湿体质者可兼血瘀[15]。消瘦体型多见于阴虚者,且伴有更多的瘀滞(血瘀)体质[16-22]。因此,在本次研究中,分为对照组、痰湿壅盛组、气阴两虚组,均为60~65岁患者,结果显示,痰湿壅盛、气阴两虚组CDKAL1、PPARG基因表达均高于对照组(P<0.000 1),且气阴两虚组CDKAL1基因表达高于痰湿壅盛组(P<0.05);气阴两虚组PPARG基因表达高于痰湿瘀滞组,但差异无统计学意义(P>0.05)。张智明等[22]对MS与脂质代谢、胰岛素抵抗等生物学指标进行研究显示其间存在明显相关性,与本研究结果相似。笔者也考虑到可能由于气阴两虚的MS患者,由于病程前期多种病理产物积聚,化生郁热者居多,暗耗阴液[17-20]。所以笔者得出,CDKAL1、PPARG两种基因与MS患者呈一定关系,可能是老年气阴两虚MS患者的高危险因子,对指导临床治疗有一定的意义,是MS证型研究的一种新视角;MS患者不同证型痰湿壅盛组、气阴两虚组CDKAL1、PPARG基因表达有所差异,原因可能与MS形成的病因病机有关:本虚标实,正虚-脾肾气虚,邪实-含痰浊、血瘀、肝胃郁热、邪毒等。平素过食肥甘厚腻等食物,则可酿生痰湿,中年以后,脏气逐渐衰退,其中尤以脾肾为主,肾精亏耗,肾虚难以气化泄浊;脾气不足,脾虚生湿,湿蕴生热,致痰湿热毒趋下为患[21]。当然本研究仍存在一定的局限性,首先样本量相对较小,可能存在未测量的混杂因素;其次本研究虽然选择MS的易感基因进行检测,但未能排除其他的易感因素的存在,并不能揭示MS证型与基因表达之间的直接因果关系。后续将扩大样本量,扩大研究对象人群,以及进行纵向研究。

综上所述,MS患者CDKAL1、PPARG基因表达均上调,与不同证型-痰湿壅盛与气阴两虚呈一定的相关关系。

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(收稿日期:2019-01-17) (本文编辑:董悦)

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