肝衰竭患者外周血Th17/Treg比率测定的价值及其与短期转归的关系

刘华春 杨根 郑恒 胡巧 郭辉

研究表明，CD4+ T淋巴细胞参与肝衰竭进展过程，Th17、Treg细胞均为这类细胞的重要成员，对机体免疫有调节作用，可影响患者预后[1]。Th17细胞能分泌多种白细胞介素(IL)，包括IL-21、IL-17等[2]。有学者发现Th17细胞表达水平与肝功能损害程度有关[3]。Treg细胞在HBV相关肝炎中呈高表达，而对急性HBV感染者而言，早期呈低表达，随着病情改善，其表达水平逐渐增高[4]。本研究旨在分析肝衰竭患者外周血Th17/Treg比率的变化，并探讨其与短期转归的关系。

资料与方法

一、一般资料

选取廉江市人民医院2016年5月—2018年5月收治的肝衰竭患者60例，将其作为肝衰竭组，选取同期收治的60例健康体检者作为对照组。肝衰竭组男31例，女29例，年龄31～76岁，平均(59.78±16.59)岁；体质指数(18～24)kg/m2，平均(21.17±1.06)kg/m2；肝衰竭类型：急性肝衰竭34例，慢加急性肝衰竭26例。对照组男34例，女26例，年龄30～78岁，平均(60.72±15.24)岁；体质指数(18～24)kg/m2，平均(21.35±1.01)kg/m2。研究方案获得本院伦理委员会批准，两组基线资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。

肝衰竭诊断符合我国《肝衰竭诊治指南(2012年版)》标准[5]。纳入标准：(1)诊断明确；(2)入院前6个月内无免疫调节、护肝治疗史；(3)知情同意。排除标准：(1)恶性肿瘤；(2)酒精性肝病；(3)肾、心、脑等器官损害；(4)药物性肝病；(5)自身免疫性疾病。

二、检测方法

主要仪器包括离心机(迈克尔)、流式细胞仪(贝克曼库尔特)，主要试剂包括红细胞裂解液(博士德生物)、淋巴细胞分离液(博士德生物)、细胞固定破膜液(博士德生物)。Treg细胞检测：取100 μL外周血，加CD25-PE、CD4-APC各10 μL，在4 ℃条件下反应30 min，将红细胞溶解。固定破膜，取5 μL Foxp3-FITC及同型抗体加入，在4 ℃条件下反应30 min。洗涤，测定CD4+CD25+Foxp3+/CD4+T细胞，获得Treg细胞频率。Th17细胞检测：经淋巴细胞分离液将单个核细胞分离，细胞数调整为2×106/mL，加细胞刺激剂，在37 ℃环境下反应5 h，获得细胞。取10 μL CD8-FITC、5 μL CD3-PERCP-CY5.5加入，在4 ℃条件下放置30 min，洗涤，测定CD3+CD8-IL-17A+/CD3+CD8- T细胞，获得Th17细胞频率。

三、观察指标

观察并比较两组受检者的Th17细胞频率、Treg细胞频率以及Th17/Treg。绘制ROC曲线分析其对急性肝衰竭的预测价值，获得曲线下面积、最佳截断值以及相应的敏感度、特异度。利用电话对肝衰竭患者进行6个月的随访跟踪，记录随访期间内的生存、死亡情况，并据此分成生存组、死亡组，比较两组Th17细胞频率、Treg细胞频率以及Th17/Treg，绘制ROC曲线分析其对患者预后的预测价值。

四、统计学方法

结 果

一、肝衰竭组、对照组的Th17、Treg细胞及Th17/Treg比较

肝衰竭组Th17细胞、Th17/Treg水平高于对照组，Treg细胞低于对照组(P<0.05)。见表1。

二、各指标对肝衰竭的预测价值分析

Th17、Treg细胞及Th17/Treg预测肝衰竭的曲线下面积分别为0.669、0.696、0.710， Th17细胞>4.710%、Treg细胞<2.980%、Th17/Treg>2.401时，肝衰竭患病风险增加，见表2。

表1 肝衰竭组、对照组的Th17、Treg细胞及Th17/Treg比较(±s)

三、生存组、死亡组的Th17、Treg细胞及Th17/Treg比较

在随访期间，有14例死亡，占23.33%，46例生存，占76.67%。生存组Th17细胞、Th17/Treg水平低于死亡组，Treg细胞高于死亡组(P<0.05)。见表3。

表3 生存组、死亡组的Th17、Treg细胞及Th17/Treg比较(±s)

四、各指标对肝衰竭预后的预测价值分析

Th17、Treg细胞及Th17/Treg预测肝衰竭预后的曲线下面积分别为0.681、0.670、0.754， Th17细胞>6.625%、Treg细胞<1.859%、Th17/Treg>3.045时，肝衰竭患者死亡风险增加。见表4。

讨 论

本研究发现与健康体检者相比，肝衰竭患者的Th17细胞、Th17/Treg水平明显增高，而Treg细胞水平下降。Th17细胞分化对局部微环境有较大依赖性，其分化最早经白介素-6、转化生长因子-β刺激所引起，从而促进白介素-21分泌，促使Th17细胞增殖，这对白介素-23受体表达存在诱导作用，对机体免疫有调节作用。研究表明Th17细胞所分泌的因子参与了肿瘤、感染、宿主防御等病理改变进程，此外，IL-17R作为其受体，在肝脏中也有分布[6]。在感染早期阶段，IL-17便能对炎症反应进行介导[7]。本研究提示肝衰竭患者Th17细胞水平增高，这表明与之相关的炎症因子也参与了该病进展过程，如IL-6、IL-17等。有研究发现，IL-17在血清中的表达与急性肝损伤程度呈正相关，当出现急性肝损伤时，IL-7在血清内含量明显增高[8]，这为本研究提供了理论依据。

表2 各指标对肝衰竭的预测价值分析

表4 各指标对肝衰竭预后的预测价值分析

本研究绘制了ROC曲线，证实Th17、Treg细胞及Th17/Treg对肝衰竭的预测具有一定价值，其中以Th17/Treg比率的预测效果最好，临床可将其作为这类患者的重点监测指标，便于进一步分析其病情变化。Treg与Th17的功能、细胞分化属于相互抑制、制约的关系，当二者处于平衡状态时，才能确保机体内环境稳定性，而一旦二者比率失衡，则会引起持续感染、恶性肿瘤等病变[9]。当肝脏受损后，IL-23分泌量增加，促进Th17细胞增殖，增加IL-22、IL-17等因子的分泌量，导致Th17型免疫应答形成[10]。在这种情况下，CD4+T细胞主要向Th17细胞分化，致Treg细胞分化减少，导致其水平下调。因此，肝衰竭患者的Th17细胞、Th17/Treg水平增高，Treg细胞下降。

本研究提示与死亡组相比，生存组的Th17细胞、Th17/Treg水平明显下调，而Treg细胞水平上调，这表明Th17/Treg比率的失衡状态逐渐得到纠正。通过绘制ROC曲线，提示Th17、Treg细胞及Th17/Treg能预测肝衰竭患者的预后。急性肝损伤会引起肠道菌群紊乱，引起血清IL-6、IL-23水平上调，导致Th17/Treg失衡，从而进一步破坏机体免疫，促进细菌易位。在经过治疗后，患者的肠道菌群紊乱状态逐渐纠正，有利于抑制IL-6、IL-23等因子的分泌，减轻机体炎症，上调Th17/Treg比率。