三阴性乳腺癌组织中P53、Ki67、CK5/6表达分析

韩洁洁，韩丽丽，杨伟伟，王玉治

(1德州市第二人民医院，山东德州253000；2德州市人民医院)

乳腺癌发病率呈逐年上升趋势且发病年龄越来越年轻化[1]。乳腺癌是具有异质性的肿瘤，其中三阴性乳腺癌(TNBC)是其一种特殊亚型，其特点是雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人类表皮生长因子受体2(Her-2)三者均为阴性。TNBC患者的临床治疗方案与非三阴性乳腺癌(NTNBC)患者相比较为单一，针对ER、PR的内分泌治疗及Herceptin靶向治疗效果均不佳。因此，寻找能够筛选高危人群、评估患者预后及指导治疗的标志物对TNBC的防治具有十分重要的意义。P53是目前已知的肿瘤抑制基因之一，与人类肿瘤发病相关性较高。Ki67是细胞增殖活性标志物，可反映细胞的增殖及分裂能力。CK5/6特异表达于导管上皮的基底层细胞，是基底样型乳腺癌的免疫组化标志物之一[2]。本研究观察了TNBC组织中P53、Ki67、CK5/6的表达变化，分析三者与TNBC临床病理参数的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2015年1月～2018年10月在德州市第二人民医院就诊的乳腺癌患者469例，选择TNBC患者纳入TNBC组。TNBC组病例纳入标准：①有完整的临床病理资料；②手术前均未接受新辅助化疗、内分泌治疗和放疗等治疗；③病例均为没有家族史的女性患者，未合并有其他部位恶性肿瘤；④患者采用术式为乳腺癌改良根治术或乳腺癌根治术或保乳手术+腋下淋巴结清扫术，术后病理腋下淋巴结的检出数目不少于15个。共有52例患者纳入TNBC组，年龄28～78岁、中位年龄42岁；未绝经35例、绝经17例；肿瘤直径≤2 cm 20例、2～5 cm 22例、≥5 cm 10例；组织学分级Ⅰ级4例、Ⅱ级34例、Ⅲ级14例；临床分期0～Ⅰ期7例、Ⅱ期32例、Ⅲ～Ⅳ期13例；病理类型为浸润性癌非特殊型33例、浸润性小叶癌12例、乳腺导管内癌3例、伴有髓样癌特征的浸润性癌4例；无淋巴结转移34例、有淋巴结转移18例。选择100例NTNBC患者纳入NTNBC组，年龄32～72岁、中位年龄48岁；未绝经65例、绝经35例；肿瘤直径≤2 cm 30例、2～5 cm 64例、≥5 cm 6例；组织学分级Ⅰ级12例、Ⅱ级80例、Ⅲ级8例；临床分期0～Ⅰ期12例、Ⅱ期76例、Ⅲ～Ⅳ期12例；病理类型为浸润性癌非特殊型63例、浸润性小叶癌22例、乳腺导管内癌8例、伴有髓样癌特征的浸润性癌7例；无淋巴结转移62例、有淋巴结转移38例。两组一般资料具有可比性。患者及其家属均对本研究知情同意。本研究获德州市第二人民医院伦理委员会批准。

1.2 P53、Ki67、CK5/6检测 将两组患者手术标本经4%中性甲醛固定，石蜡包埋，常规切片。采用免疫组织化学SP法检测乳腺癌组织中的P53、Ki67、CK5/6。阴性对照用蒸馏水代替一抗，实验时用已知明确的阳性切片作为阳性对照，具体操作步骤按照试剂说明书进行。P53阳性细胞为细胞核着色，呈棕黄色颗粒。阳性细胞百分比<10%为P53阴性，阳性细胞百分比>10%为P53阳性。Ki67定位于细胞核，阳性细胞为细胞核着色呈棕黄色颗粒者。低倍显微镜(100×)下选取5～10个热点区域，转入高倍镜(400×)，取10个高倍镜视野，计算高倍视野中阳性细胞百分比。阳性细胞百分比<20%为Ki67低表达、判定为阴性，≥20%为Ki67高表达、判定为阳性。CK5/6定位于细胞质，阳性细胞为细胞质有棕黄色颗粒者。阳性细胞百分比<10%为CK5/6阴性，>10%为CK5/6阳性。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验。相关性分析采用Spearman等级相关分析法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组P53、Ki67、CK5/6表达比较 TNBC组P53、Ki67、CK5/6阳性表达率分别为67.3%(35/52)、76.9%(40/52)、71.2%(37/52)，NTNBC组P53、Ki67、CK5/6阳性表达率分别为45.0%(45/100)、58.0%(58/100)、8.0%(8/100)。TNBC组织中P53、Ki67、CK5/6阳性表达率高于NTNBC组(P均<0.05)。

2.2 P53、Ki67、CK5/6的表达与TNBC临床病理参数的关系 P53在TNBC中的表达与患者年龄、月经状态、组织学分级和淋巴结转移情况有关(P<0.05)。Ki67在TNBC中的表达与组织学分级和临床分期有关(P均<0.05)。CK5/6在TNBC中的表达与肿瘤直径、患者年龄、月经状态、组织学分级、淋巴结转移情况和临床分期均无相关性(P均>0.05)。见表1。

表1 P53、Ki67、CK5/6表达与TNBC临床病理参数的关系

2.3 P53、Ki67 和CK5/6在TNBC组织中表达的相关性 TNBC组织中，P53表达与Ki67、CK5/6表达均呈正相关(r分别为0.299、0.280，P分别为0.031、0.043)；Ki67表达与CK5/6表达呈正相关(r=0.356，P=0.01)。

3 讨论

TNBC占乳腺癌的15%～25%[3]，是一种特殊的乳腺癌亚型。相对于NTNBC，TNBC病理形态上细胞异型性较大，分化程度较低，生物学行为上细胞增殖更快，常伴有肿瘤坏死，并早期可出现转移，传统内分泌治疗效果不佳，且缺乏针对Her-2的特异性靶向治疗，患者临床预后差[4]。

TNBC的发生发展是一个受到多种因素调节的复杂过程，与原癌基因激活及抑癌基因失活密切相关[5]。P53基因位于人染色体17P13.1，是目前研究最多的抑癌基因之一，其重要作用主要表现在维持细胞基因组完整性、修复损伤DNA片段和调节细胞周期方面[6]。正常的P53表达产物半衰期较短，不易被检测到，其作用是抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡；当P53发生突变后，表达产物的半衰期延长，可以被检测到。突变后的P53不仅失去了抑癌功能，还可诱导正常细胞向肿瘤细胞转化，同时阻碍未发生突变的野生型P53的抑癌作用，最终促进肿瘤的发生、进展[7]。突变型P53基因在乳腺癌发生、发展及预后评估中起重要作用，是乳腺癌重要的预后标志物和预测因子[8,9]。本研究中P53蛋白在TNBC组阳性表达率高于NTNBC组，与国内相关研究[5]结果一致。P53在TNBC中的表达与患者年龄、月经状态、组织学分级和淋巴结转移情况有关，说明P53表达阳性的TNBC肿瘤细胞分化程度较差，侵袭能力较强，容易复发和转移。

Ki67在具有增殖活性的细胞核中表达，其功能与有丝分裂密切相关，能够比较准确地反映细胞增殖状态，是一种最理想的也是应用最广泛的增殖细胞标志物之一。Ki67可以识别除G0期以外的G1期、S期、G2期和M期的细胞，其在低转化性的或非增生性的组织细胞中几乎无表达，在良性肿瘤病变中低表达，在恶性肿瘤中高表达。研究表明，Ki67与多种恶性肿瘤发生、发展及转归有关[10～12]。本研究结果显示，TNBC组Ki67阳性表达率76.9%，低于国内雷珍等[13]的报道，可能是Ki67的分组标准不同所致。Ki67表达随组织学分级和临床分期增高而增高，Ki67高表达提示TNBC预后不良。

CK5/6属于细胞角蛋白家族中的一员，主要表达于上皮组织的基底细胞层。乳腺导管由腺上皮细胞、基底细胞和肌上皮细胞组成。CK5/6被证实是乳腺基底细胞特异表达的CK，也是识别基底细胞样乳腺癌的重要分子标志物，并且可能是TNBC预后的独立影响因素[14]。研究发现，导管原位癌细胞中可表达CK5/6，表现出与基底细胞样乳腺癌相关的特性，提示CK5/6表达变化是乳腺癌发展的早期事件，从疾病一开始就确定了基底样乳腺癌的临床病理特征[15]。本研究中，CK5/6在TNBC组阳性表达率为71.2%，高于江科等[16]研究得出的63.8%，可能与本研究样本量较少有关。TNBC组CK5/6阳性表达率高于NTNBC组，且CK5/6在TNBC中的表达与肿瘤直径、患者年龄、月经状态、组织学分级、淋巴结转移情况和临床分期均无相关性，与国内毕晓峰等[17]研究结果一致。上述结果提示,CK5/6的表达反映了肿瘤细胞的起源，CK5/6阳性的肿瘤细胞来源于乳腺导管的基底细胞，而非腺上皮细胞，其起源是不随肿瘤自身进展而改变的。本研究通过Spearman相关分析，发现P53的表达与Ki67、CK5/6呈正相关，Ki67的表达与CK5/6呈正相关，提示乳腺导管的基底细胞在向成熟细胞转化过程中可能受到突变P53的诱导，未能转化成正常细胞而转化成为肿瘤细胞，并使得肿瘤细胞的增殖活性明显增强。

综上所述，P53、Ki67、CK5/6在TNBC组织中的表达均高于NTNBC组织，三者在TNBC发生发展过程中可能存在一定相互作用。P53、Ki67高表达与TNBC的进展有关。