狂犬病病毒糖蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

程 玮 于恒智* 牛文博 汤国谦

（1.辽宁省农业经济学校，辽宁锦州 121007；2.锦州海关，辽宁锦州 121001；3.黄埔海关技术中心，广东东莞 523000）

狂犬病是由狂犬病病毒引起的危害严重的人兽共患传染病，一旦发病，死亡率几乎是100%。近年来，亚洲的人狂犬病每年约有3.5万例，约占全世界总数的98%。自建国以来，我国死于狂犬病的人数约10万人，其中2004年死亡2651例，其病死率在所有传染病中居首位。因此，开展对犬狂犬病诊断预防的研究具有重要的社会意义。

单克隆抗体因其具有高度的同质性和特异性成为了检测病原和抗体的最佳生物探针，加之可以批量生产，易于标准化，使其在病毒血清学鉴定及诊断治疗方面得到了广泛应用。本研究旨在利用杂交瘤技术制备抗RV单克隆抗体，筛选与RV有高度亲和力和中和活性的单抗作为诊断试剂，同时也为新型疫苗的研制、流行病学研究及抗体人源化等方面的深入研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂：RabvacTM3购自美国富道动物保健有限公司；人用狂犬病疫苗购自大连金港安迪生物制品有限公司；HAT、HT选择培养基、PEG、HRP-山羊抗鼠IgG均为Sigma公司产品；FITC-羊抗小鼠IgG购自武汉博士德生物工程有限公司；所用其他化学试剂均为分析纯。

1.1.2 细胞、实验动物与毒种：BHK-21细胞、SP2/0骨髓瘤细胞均为本实验室冻存。雌性BALB/c小鼠和昆明白鼠购于卫生部长春生物制品所；CAV-2-CGS重组毒和CVS株由本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 间接ELISA和IFA检测方法的建立：具体方法按文献 [2]进行。

1.2.2 单克隆抗体的制备：用RabvacTM3腹腔注射6周龄BALB/c小鼠，0.2ml/只，两周后以同样方法进行第二次免疫；隔周以人用狂犬病疫苗进行第三次免疫。加强免疫后进行细胞融合、杂交瘤细胞的筛选、亚克隆、McAb的大量制备，以上实验按文献[2-4]进行。

1.2.3 腹水的纯化：采用辛酸-饱和硫酸铵法对制备的单抗腹水进行纯化[5]。

1.2.4 Western blot分析：将纯化的RV进行SDS-PAGE和电转印，4℃封闭过夜。洗好膜后

加入以封闭液 1：1000倍稀释的小鼠腹水200ul，室温振荡孵育1h，加入HRP-羊抗鼠IgG和底物液，室温显色。

1.2.5 相加ELISA：测定两种纯化单抗是否识别相同的抗原位点，具体测定方法按文献[6]进行。

2 结果

2.1 杂交瘤细胞系的建立及其培养上清和腹水效价的测定 经ELISA和IFA筛选和亚克隆，获得2株阳性杂交瘤细胞，命名为1G8、4G11。间接ELISA测定其培养上清及腹水效价（见表1）。

表1 杂交瘤细胞培养上清及腹水抗体效价

2.2 腹水单抗饱和值测定 经间接ELISA测定，2株阳性杂交瘤细胞腹水抗体的饱和度均为1：103（以OD490nm值明显降低的前一个稀释度作为单抗饱和浓度值）。

2.3 腹水单抗的纯化 纯化后的1G8、4G11腹水的蛋白含量分别为1.78和1.00 mg/mL，SDS-PAGE鉴定其纯度，大约在50KD和25KD处分别可见IgG重链和轻链两条特异性条带，结果见图1。

图1 SDS-PAGE鉴定纯化的1G8，4G11腹水单抗

2.4 单抗特异性鉴定

2.4.1 ELISA检测两株单抗与CVS和CAV-2-CGS的反应性：阳性对照为融合前制备的小鼠高免血清，阴性对照为SP2/0细胞上清，结果见表2

表2 间接ELISA检测2株单抗与CVS和CAV-2-CGS的反应性

2.4.2 IFA检测两株单抗与RV的反应性：将两株单抗分别与感染CVS的BHK-21细胞和感染CAV-2-CGS的DK细胞进行间接免疫荧光试验，结果见图2。

C、D：感染CVS的BHK-21细胞分别与1G8、4G11腹水的反应结果；G、H：感染CAV-2-CGS的DK细胞分别与1G8、4G11腹水的反应结果

图2 IFA检测两株单抗与CVS和CAV-2-CGS的反应结果

2.5 Western blot分析 单克隆抗体1G8与RV呈现特异反应条带，结果见图3。结合间接ELISA和间接免疫荧光实验结果，分析表明它所针对的抗原表位为线性表位。

图3 纯化的RV对2株单抗进行SDS- PAGE和Western blot分析结果1.蛋白Marker；4、5 1G8和4G11的Western-Blot分析图

2.6 单克隆抗体抗原识别位点分析 经相加ELISA测定，1G8和4G11两株单克隆抗体两两叠加后的AI值为16.8%，说明它们分别识别不同的抗原表位。

3 讨论

制备的单抗1G8在相对分子质量67000（RV糖蛋白相对分子质量大小）处出现了明显条带。由于经过SDS的作用转移到硝酸纤维素膜上的蛋白是变性的，若糖蛋白中单抗识别的抗体表位在Western blot中并未被破坏，提示这个表位的结构是线性的。因此，McAb 1G8与RV糖蛋白抗原发生反应，其识别的表位是线性的，而不是针对空间表位的。在实验过程中获得的大多数McAb，都不与变性G蛋白发生反应，也证实大多数针对糖蛋白的McAb是识别空间表位，而不是识别线性表位的这一结论。

本研究获得的针对RV糖蛋白的单克隆抗体，经生物学特性鉴定，具有效价高、特异性好的特点，可标记为指示性抗体，并为建立狂犬病病毒的竞争ELISA方法提供有力的技术支持，为我国狂犬病病毒的防制及抗体人源化等方面的深入研究奠定了基础。