HPLC法测定安乃近注射液有关物质

刘晓丹 乌日罕 毕力格 阿迪亚 王惠英

（内蒙古自治区兽药监察所，内蒙古呼和浩特 010000）

安乃近注射液为解热镇痛类药，用于肌肉痛、关节痛、偏头痛、风湿症等。安乃近注射液现收载在《中国兽药典》2015年版一部上，标准中未对有关物质进行控制检测。安乃近性质不稳定，光、热、酸、碱均可使其分解，主要降解产物为4-甲氨基安替比林。国内企业大多采用4-甲氨基安替比林与羟基次甲基磺酸钠缩合的方法生产安乃近，由于由多步化学反应过程组成，每一步几乎都有副反应发生，最终产品可能积累了多种化学杂质。《中国兽药典》2015年版一部安乃近原料药和安乃近片有关物质采用反相高效液相色谱法，色谱柱为C18，以磷酸盐缓冲液（磷酸二氢钠 6.0g，加水1000ml，加三乙胺1ml，用氢氧化钠溶液调节pH值至7.0）-甲醇（75：25）为流动相，检测波长254nm。蔡涛等人采用反相高效液相色谱法，色谱柱为C18，以磷酸盐缓冲液（磷酸二氢钠6.0g，加水1000ml，加三乙胺1ml，用氢氧化钠溶液调节pH值至7.0）-甲醇（74：26）为流动相，检测波长为246nm，检测安乃近注射液中有关物质。我们按照《中国兽药典》2015年版一部安乃近原料药和安乃近片有关物质的检测方法开展试验，本文可用于安乃近注射液有关物质控制检测，同时对样品中的安乃近注射液有关物质进行了考察。

1 仪器与试药

Waters e2695高效液相色谱仪；十万分之一分析天平（Mettler Toledo）；万分之一分析天平（Mettler Toledo）；甲醇（色谱纯，Merck）；磷酸二氢钠（天津市大茂化学试剂厂）；4-甲氨基安替比林（批号：101115-201101，中国食品药品检定研究院）。实验中所用的水均为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱条件：Waters XBridge C18（4.6 mm × 150 mm，5um）色谱柱，流动相为磷酸盐缓冲液（磷酸二氢钠6.0g，加水1000ml，加三乙胺1ml，加氢氧化钠溶液调pH至7.0）-甲醇（75︰25），流速为1.0 ml/min，检测波长254nm，进样量10μl，柱温30℃。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取4-甲氨基安替比林对照品约10mg，加甲醇溶解并定容至200ml量瓶中，摇匀，即得。

2.2.2 样品溶液的制备

取安乃近注射液样品（批号：C10181001 河北远征禾木药业有限公司）2.5ml，加甲醇定容至150 ml量瓶中，摇匀，即得。

2.3 系统适用性考察

精密称取安乃近和4-N-去甲基安乃近对照品各12.5mg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，精密量取5ml置50ml量瓶中，加甲醇定容至刻度。在2.1项下色谱条件下，进样测试，记录液相色谱图。结果安乃近峰与4-N-去甲基安乃近峰的分离度为3.9，能够符合系统适用性要求。

2.4 定量限考察

取2.2.1项下的对照品溶液，用甲醇逐级稀释成系列浓度的溶液，按2.1项下色谱条件测定，记录色谱图，以信噪比10：1为定量限。结果4-甲氨基安替比林定量限为0.4μg/mL。

2.5 线性关系考察

精密称取4-甲氨基安替比林对照品约40m g，配制成对照品系列浓度，按2.1项下色谱条件测定，记录色谱图。以4-甲氨基安替比林溶液浓度为横坐标（X），以相应的峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。结果4-甲氨基安替比林质量浓度 在 0.0004076 ～ 0.4075 mg/ml（Y=2.43e+007X-3.27e+003，R2=0.9999）与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.6 专属性考察

2.6.1 干扰试验

溶剂空白：甲醇作为溶剂空白；对照品溶液：精密称取4-甲氨基安替比林对照品约10mg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度；样品溶液：同2.2.2项下。分别取上述对照品溶液、溶剂空白、样品溶液各10 μl进样测试，得到4-甲氨基安替比林保留时间。

结果对照品溶液4-甲氨基安替比林的保留时间为14.547min，样品溶液4-甲氨基安替比林的保留时间为14.552min，表明对照品溶液和样品溶液中4-甲氨基安替比林的保留时间基本一致。在溶剂空白图谱中，安乃近峰及4-甲氨基安替比林峰处无干扰。

2.6.2 破坏性试验

取6份安乃近注射液样品溶液各2.5～150 ml容量瓶中。其中一份不作处理，将其他5份安乃近注射液样品溶液分别进行盐酸降解、氢氧化钠降解、100℃水浴降解、过氧化氢降解和光照降解。取上述溶液，在2.1项下的色谱条件下进样，考察降解情况。结果样品溶液在酸、碱、高温、氧化和光照下降解，破坏量（主峰面积下降%）范围是6.7～51.4%，主峰纯度角均小于主峰纯度阈值，均为单一物质峰。结果表明，该方法专属性良好。

2.7 精密度考察

2.7.1 重复性考察

取2.2.1项下的对照品溶液和2.2.2项下的样品溶液各10μl，在2.1项下的色谱条件，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果4-甲氨基安替比林为标示量的百分含量平均值为2.7%，RSD为0（n=6），表明该测定方法重复性良好。

2.7.2 进样精密度考察

取2.2.1项下的对照品溶液10μl，连续进样6次。结果4-甲氨基安替比林峰面积RSD为1.0%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.7.3 中间精密度考察

精密量取2.2.2项下的样品溶液10μl，由不同的检测人员在不同日期分别配制样品溶液，连续进样6次，记录色谱图。结果甲、乙两个检验人员测得4-甲氨基安替比林峰面积的RSD（n=6）分别为0.5%和0.6%，表明仪器中间精密度良好。

2.8 耐用性考察

取2.2.1项下的对照品溶液和2.2.2项下的样品溶液10 μl进高效液相色谱仪，通过改变温度、改变流速、改变酸碱度、更改流动相比例、更换色谱柱，分别记录对照品溶液和供试品溶液的峰面积，计算4-甲氨基安替比林为标示量的百分含量。结果通过改变温度、改变流速、改变酸碱度、更改流动相比例、更换色谱柱等条件，4-甲氨基安替比林为标示量的百分含量均为2.7%，说明该方法耐用性良好。

2.9 回收率考察

精密量取2.2.2项下的样品溶液1 ml，加入4-甲氨基安替比林对照品，记录4-甲氨基安替比林的峰面积，计算4-甲氨基安替比林的回收率。由表1可知，4-甲氨基安替比林的回收率为97.35～101.16%，平均回收率为99.9%，RSD为1.7%，表明符合方法学要求。

表1 回收率实验结果

2.10 稳定性考察

取同一批样品为考察对象，分别在1、2、4、8、16、24 h考察其稳定性，在2.1项下的色谱条件下进样，记录4-甲氨基安替比林的峰面积。结果4-甲氨基安替比林的峰面积RSD为1.8%（n=6），表明样品溶液在24h内稳定性良好。

2.11 有关物质的测定

取市场抽检的47批次样品，按2.2.1和2.2.2项下配制对照品溶液和样品溶液，在2.1项下色谱条件进样测试。由表2可知，4-甲氨基安替比林小于标示量3.0%的有3家企业的6批次样品，占比12.7%；4-甲氨基安替比林在标示量3.0～4.0%（含3.0%）之间的有6家企业7批次样品，占比14.9%；4-甲氨基安替比林在标示量的4.0～5.0%之间的有2家企业2批次样品，占比4.2%；4-甲氨基安替比林在标示量的5.0～6.0%之间的有4家企业4批次样品，占比8.5%；4-甲氨基安替比林在标示量的6.0～7.0%之间的有7家企业10批次样品，占比21.3%；4-甲氨基安替比林在标示量的7.0～8.0%（含7.0%）之间的有11家企业18批次样品，占比38.3%。 其中46批次产品其他各杂质峰面积的和均小于对照溶液中安乃近峰面积（1.0%），占比97.9%。

3 讨论

本文建立了测定安乃近注射液有关物质的方法，拟订的安乃近注射液有关物质检测方法经方法学验证证实可行，简便、快捷、稳定性好，重复性好，回收率高。我们测定的47批次产品全部来源于市场抽检，产品批号涵盖2017～2019，随机性强，真实反映安乃近注射液有关物质状况。该方法可用于安乃近注射液有关物质的质量控制。

表2 有关物质试验结果