山东省某地鹦鹉喙羽病病毒的全基因组序列及对SPF鸡胚的致病性探究

吴少鹏 宋 艳 孙淑红

(山东农业大学动物科技学院，泰安，271000)

PBFD是一种在世界范围内的鹦鹉鸟类中常见的、慢性的、最终致死鹦鹉的病毒病[1]。到目前为止，已经在地球上超过60种鹦鹉鸟中发现了PBFDV[2]，占到鹦鹉类物种的10%以上[3]。尤其对濒危物种构成了巨大威胁[4]。PBFDV可以追溯到白垩纪澳大利亚古老的Psittacopasserine圆环病毒[5-6]，属圆环病毒科(Circoviridae)的圆环病毒属(Circovirus)。形态学上，14—16 nm，无包膜的二十面体形病毒，含有一个2 000 bp[7]的单链环状ssDNA基因组，其中包括两个相反方向的主要开放阅读框(ORFs)，一个编码衣壳蛋白(CP)，另一个编码复制相关蛋白(REP)[8]。由于圆环病毒的物理化学特性，该病毒在体外环境中非常稳定，能够防御恶劣和干燥的环境，高温和化学攻击[9]。尽管它可能是感染脊椎动物的最简单的病原体，但它被认为是慢性病患者免疫抑制的原因[10]。受感染的鹦鹉很容易被细菌、真菌和病毒继发感染[11]。感染PBFDV的大多数鹦鹉表现出异常形状的喙、羽毛脱落[12]，羽毛萎缩，抑郁，营养不良[10，13]和皮肤表面寄生虫的存在。它可以引起白细胞凋亡，并对法氏囊造成损伤，脾脏、胸腺和肝脏肿大，并可以观察到肺和胸腺，上皮和心内膜组织的出血[14]。最常见的病理变化是淋巴器官中T淋巴细胞的迅速减少，如胸腺、脾脏和法氏囊[14]。它能通过在受感染的父母[15]通过卵或喂养期间[16]垂直传播，通过羽毛粉尘、粪便和碎片在水平方向上进行传播，但水平传播更为严重[17]。然而，还未有商业化疫苗用于生产过程，并且未能在任何细胞或培养物中繁殖PBFDV[18]。一般来说，由于感染的流行和病毒的稳定性，治愈疾病的可能性不大，因此，鹦鹉病通常接受姑息治疗和支持治疗[19]。早期识别PBFDV感染对于降低鹦鹉死亡率和经济损失具有重要意义[20]。

1 材料和方法

1.1 道德声明

根据鹦鹉主人的意愿，批准了对动物进行的所有处理。

1.2 患病鹦鹉临床情况

共收集了3只非洲灰鹦鹉(Psittacuserithacus)进行下一步试验。我们观察了鹦鹉的整体健康状况，并调查了鹦鹉的喂养和管理情况。检查鸟的形态特征和组织器官的变化，采集新鲜皮肤组织进行组织病理学分析，新鲜的肝脏和羽毛样品用于DNA提取。

1.3 主要试剂

DNA Marker DL2000、pMD19-T克隆载体、Tris平衡酚购自TaKaRa。 TARANS 5α购自Biotech，琼脂糖凝胶回收试剂盒购自OMEGA，PCRTaq酶购自康为世纪。琼脂糖，氨苄西林，蛋白酶K购自Amresco。LB培养基购自Invitrogen，50×TAE购自索莱宝。无机试剂，如PBS，无水乙醇和氯仿，均由国内生产，分析纯。

1.4 引物合成

根据GenBank上公布的标准序列，为PBFDV全基因组设计引物，估计的片段大小为约2 000 bp。由铂尚公司合成，序列如下：

PBFDV-F：ATGGGCGGGGCTTGCATAACCTCT

PBFDV-R：GCCTGACGTAGATATCCGGGAACTCTCGC

1.5 DNA组织的提取

取出储存在冰盒中的新鲜肝脏和羽毛组织，然后提取DNA[21]。

1.6 PCR程序

使用设计的引物PBFDV-F和PBFDV-R进行PCR程序。2 μL DNA模板，将含有2.5 μL 10 × mix缓冲液，2 μL dNTP，0.5 μL各引物和0.2 μL 1UTaq酶的PCR混合物加入双蒸水至23 μL。PCR反应条件如下优化：95℃，5 min；94°C，45 s；59℃，45 s；72℃，1 min。35个循环，最后72℃，10 min。通过琼脂糖凝胶电泳收集预期长度的PCR产物，并且将该片段用凝胶回收试剂盒回收，并在-20℃保存。

1.7 重组质粒的构建和测序

根据pMD19-T载体说明书，我们将胶回收产品与载体连接并转化，涂抹在含有氨苄西林的平板并在37℃下培养。将单菌落接种在LB液体培养基中，并用菌液作为样品进行PCR。在阳性样品中提取DNA后对质粒进行测序。

1.8 组织病理学分析

通过常规组织学方法处理福尔马林固定的新鲜皮肤，将收集的新鲜皮肤组织置于4%多聚甲醛溶液中(厚度一般小于0.5 cm)，48 h后固定冲洗，将切片从低浓度移至高浓度酒精中，然后置于二甲苯中。接下来，将样品置于熔化的颗粒石蜡中包埋并冷却，将它们切成4—5 μm厚的切片，将切片熔化并附着到处理过的载玻片上，然后干燥，HE染色。使用Olympus BX显微镜和相机进行成像。

1.9 序列分析

将获得的基因序列与GenBank相应片段序列中的其他公开的PBFDV进行比较，并通过DNAstar软件进行分析。

1.10 PBFDV对SPF鸡胚的致病性

如前所述，迄今为止，我们没有发现适合PBFDV繁殖的细胞或其他培养物。我们大胆地假设是否可以使用SPF鸡胚来复制病毒。取适量通过PCR鉴定阳性的羽毛囊置于ep管中充分剪至糊状，加入0.5 mL灭菌PBS混匀，置于-80 ℃冰箱反复冻融3次，然后在4℃下以8 000×g离心5 min，通过0.22 μm过滤器并接种到7日龄SPF鸡胚的卵黄膜(购自济南斯帕法斯公司)。将鸡胚置于37℃培养箱中。记录死亡时间，并在收集死胚的肝脏提取DNA，检测是否存在PBFDV感染。

2 结果

2.1 患病鹦鹉的临床观察

通过观察，我们发现患病的灰鹦鹉精神沉郁，翅膀下的绒毛和长红尾羽毛消失，少数脚趾脱落。尸检后，发现肝脏弥漫性增大并易碎(图1)。

2.2 组织病理学分析

在40倍放大显微镜下，我们观察到大量上皮细胞的损失，并且细胞之间的连接性是不完整的。当使用更大的放大倍数时，我们发现少数淋巴细胞聚集并且出现散发的嗜异性细胞，表明炎症反应。

2.3 PBFDV全基因的PCR扩增

从患病鹦鹉材料和羽毛囊组织中提取的DNA模板中扩增出PBFDV的全基因片段。琼脂糖电泳(1.2%)证明获得了与预期片段大小(2 000 bp)一致的清晰单一条带(图2A)。

2.4 重组T载体的构建与鉴定

将回收的DNA片段与pMD19-T载体连接，并转化到Trans5α大肠杆菌(Escherichiacoli)中。在氨苄西林平板上筛选白色菌落，接种在含有氨苄西林的LB培养基中并摇动培养。通过PCR验证阳性菌落。然后我们发现扩增了2 000 bp的条带以确认整个基因组被插入T载体中(图2B)。

2.5 序列同源性和系统发育分析

提取重组质粒并测序后，全基因组序列的BLAST分析显示GenBank中PBFDV分离株的同源性为86.1%—98.8%(图5，表1)。系统发育树显示PBFDV与地理位置和宿主有一定的相关性。本研究中分离的1号菌株和从波兰分离的菌株，分离出2号和3号菌株与从英国分离的菌株在一个分支上。宿主都是灰鹦鹉，具有密切的遗传关系(图4)。

2.6 PBFDV对鸡胚的致病性

PBFDV能延缓鸡胚胎发育并导致整个身体在72 h内出血死亡(图6A)，甚至尿囊液也变红(图6B)。传代至第5代时仍然会出现这种现象。提取死亡鸡胚肝脏DNA的可以扩增出目标条带(图2C)。PBFDV在短期内可以在SPF鸡胚中复制。与此同时，我们也检测了其他常见疾病的禽类，如禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒和禽腺病毒均显示为阴性。更深入的研究还在继续。

图1 病鹦鹉的临床观察A.翅下灰绒毛的脱落；B.长红尾羽毛脱落；C.脾脏肿大Fig.1 Clinical observation of sick parrotsA.Loss of gray wing villus.B.Loss of red tail feather.C.Enlargement of spleen

图2 患病鸟类皮肤的组织学分析 HE染色A.C.上皮细胞的丧失和细胞连接不完整；B.淋巴细胞聚集和散在的嗜异性粒细胞Fig.2 Histology of skin in an affected bird.H&EA.C.Loss of epithelial cells and the connectivity between cells was incomplete.B.Lymphocytes clustered and sporadic heterophils

图3 琼脂糖凝胶电泳的结果A.从患病的非洲灰鹦鹉中扩增PBFDV的全基因组；B.重组质粒的鉴定；C.从感染的鸡胚中扩增每一代PBFDV，G1—G5分别代表第一至五代Fig.3 Results of agarose gel electrophoresisA.Amplification of the full genome of PBFDV from the ill African grey parrots.B.Identification of recombinant plasmids.C.Amplification of the every generation of PBFDV from the infected chicken embryos

图4 GenBank中收集的参考序列和本实验获得的基因组的遗传进化比较Fig.4 Genetic evolution of collected sequences and reference strains in GenBank

图5 GenBank中收集的参考序列和本实验获得的全基因组的同源性比较Fig.5 Homology comparison of collected sequences and reference strains in GenBank

图6 鸡胚的观察(注射后72 h)A.注射病毒的鸡胚与对照鸡胚的比较；B.注射病毒的鸡胚的尿囊液Fig.6 Observation of chick embryos(72 h after injection)A.Comparison of chicken embryos injected with virus and control chicken embryos.B.Allantoic fluid of chicken embryos injected with virus

表1 GenBank中一些鹦鹉喙羽病病毒的代表株Tab.1 Some representative psittacine beak and feather disease virus in GenBank

续表1

3 讨论

鉴于PBFDV像其他环状病毒类似的高度多样性，该病毒极易突变和重组，进行全基因组分析以确定鹦鹉的当地群体中的病毒动态是有必要的。我们从3只非洲灰鹦鹉中获得了PBFDV的基因组。这3个基因组在GenBank中可用的其他PBFDV基因组之间序列相似性为93.3%—99.9%。3个PBFDV基因组序列中的第1个与从波兰分离株最接近，而第2和第3个与从英国分离株非常接近。总的来说，这3个基因组与其他已知的PBFDV基因组序列相似性在86.1%—98.8%之间。获得的第一个完整基因组(GenBank登录号MH279594)是1 991 bp，G + C含量为53.14%，而第2和3号(GenBank登录号MH180298和MH190788)其基因组是2 000 bp，G + C含量分别为52.85%和52.95%。这3种都与其他参考PBFDV基因组相似，基本结构包括两个主要的ORF，分别为ORF1和ORF2，且含有编码Rep和CP的基因。这是山东省非洲灰鹦鹉PBFDV基因组的首次报道，丰富了中国东部地区获得的PBFDV基因组数据。这种病毒最早只发现于澳大利亚的野生鹦鹉[10]，但近年来随着世界鸟类贸易蔓延到世界大部分地区，包括英国、德国、葡萄牙、美国、南非等地[22]。起初，没有关于中国大陆鹦鹉病暴发的报道，但随着近年来全球鸟类贸易的迅速发展，携带病毒的鹦鹉将病毒带到了中国，这项研究中的鹦鹉也是从其他地方进口的。作为一种重要的经济动物，鹦鹉在病毒爆发时很容易造成高经济损失，因为与其他家禽相比，它们更加昂贵。中国的鹦鹉养殖业正在兴起，基本保障措施尚未完善，没有统一的养殖标准以及应对该病毒感染的措施。

目前，对于鹦鹉或其他鸟类的圆环病毒感染没有有效的治疗方法。治疗只能基于支持疗法，补充免疫刺激剂和维持环境清洁。PBFDV的致病性和危害性很小，单独感染圆环病毒时鸟类不会造成明显的伤害。大多数感染了圆环病毒的禽类死于继发感染病毒、细菌等。我们应该更加重视原发性继发感染的诊断并相应地进行治疗。完全灭活PBFDV非常困难，并且在未完全灭活病毒的情况下贸然对易感鸟类进行免疫，极易引起病毒感染。因此，使用来自受感染鸟类组织的全病毒灭活疫苗是非常危险的。外部病毒的持续存在和无法治愈导致科研人员将研究重点放在开发针对PBFDV的疫苗。由于还未有商品化的疫苗应用，目前的研究主要集中在重组基因亚单位疫苗的开发上，但尚处于研究阶段。疫苗开发主要依靠重组DNA技术在少数表达系统中产生病毒抗原。该方法主要通过产生PBFDV的主要抗原决定簇，衣壳蛋白(CP)，由几个群体用杆状病毒-昆虫细胞系统表达[23]，并且观察到重组CP自组装成病毒样颗粒(VLP)[4]。该制剂用于接种Cacatuatenuirostris，并显示可以防止PBFDV被感染[24]。然而，目前尚未报道基于可溶性PBFDV CP的亚单位疫苗的免疫原性。同样地，PBFDV CP的N-末端部分的缺失导致昆虫细胞中截短的CP的表达增加[23]。特别地，前40个N-末端氨基酸的缺失导致截短的蛋白质CPΔN40的表达水平增加，这有利于产量。此外，在之前的一项研究中，接种了昆虫细胞中产生的PBFDV VLP的禽类在受到感染禽类分离的活PBFDV威胁时受到保护[4]。在大肠杆菌中表达的截短的PBFDVCPΔN40用于提高鸡的抗体水平[25]。然而，在细菌或昆虫病毒表达系统中，PBFDV CP的产量都很低[23]，这表明需要高成本才能产生足够量的疫苗。

通过用羽毛匀浆中的纯化病毒感染鹦鹉可以成功复制PBFD[26]。可以通过用来自患病鹦鹉的羽毛匀浆接种原代鸡胚成纤维细胞来分离PBFDV病毒[27]。然而，其他学者的研究不能重复实验结果[28]。在本研究中，我们使用7日龄SPF鸡胚蛋黄膜作为培养条件，从死亡鸡胚的肝脏DNA中扩增出目标条带。我们的实验结果显示PBFDV可以通过在卵黄囊接种的方式短期内在SPF鸡胚中繁殖。不同学者的研究结果不同可能的原因是选择鸡胚的日龄不同，接种位置不同，而病毒繁殖对鸡胚接种位置具有特异性，很可能会导致实验结果的差异。至于该病的预防，鹦鹉养殖场的主人应保持良好的常规饲养管理和预防措施。加强鹦鹉的营养供应，并在饲料中加入适量的维生素和微量元素，以提高免疫力。进口时，必须检查新鸟的健康状况。在鸟类与场地中的鸟类混合之前，必须至少两周对鸟类进行检查和观察。应避免不同年龄的混合育种，必须加强进出口统一战略。如果鸟场有可疑的爆发，我们应该快速做出确诊，并且隔离病禽。同时，如果我们能够建立可靠简单的核酸和血清学检测方法，进行全面系统的流行病学调查以确定阻止其水平或垂直传播的因素，会更有利于该病的防控。

4 结论

我们的研究结果显示了中国山东省鹦鹉养殖场PBFDV的分子特征。农场中的非洲灰鹦鹉被PBFDV污染，这可能来自鸟类贸易路线。在中国预防和控制PBFDV非常重要。我们建立了一种新型高效的PBFDV培养体系，有利于为进一步研究该病毒创造有利条件。