黑鹳微卫星位点的筛选及遗传特点分析

仲光启 由玉岩 徐艳春，3，4 刘学锋 贾 婷金继英 郭爱霞 张丽霞 杨淑慧*

(1.东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨，150040；2.北京动物园圈养野生动物技术北京市重点实验室，北京，100044；3.国家林业与草原局野生动物保护与利用工程技术研究中心，哈尔滨，150040；4.国家林业和草原局野生动植物检测中心，哈尔滨，150040；5.保定市动物园管理处，保定，071000；6.济南动物园管理处，济南，250031；7.太原动物园，太原，030009)

黑鹳(Ciconianigra)属鹳形目(Ciconiiformes)鹳科(Ciconiidae)鹳属，无亚种分化，是一种体态优美、分布广泛、性情机警的大型涉禽，亚欧非均有其分布记载[1-4]。但黑鹳对栖息地环境，特别是觅食生境的要求极为苛刻，且食性较为单一[1，5]。因受气候变化、栖息地破坏、人类活动等影响，黑鹳的种群数量急速下降。据2006年罗祖奎等的研究，全国野外的种群数量在1 000只左右[6]。目前黑鹳已被列入《中国濒危动物红皮书·鸟类》和《华盛顿公约·附录II》[2]，因此，黑鹳的保护十分迫切。

国内外围绕黑鹳的研究已经积累了一些资料，主要围绕繁殖生态[7-11]、人工饲养技术[12-15]、性别鉴定[16-20]、疾病救护[21]、食性[5，22-23]、迁徙[24-27]、行为及越冬[28-31]等，为黑鹳的保护提供了基本依据。人工饲养繁育是濒危物种保护的重要手段，也是野化放归的基本前提。目前，在中国的动物园中饲养黑鹳的数量约150只，主要集中在保定动物园、石家庄动物园、太原动物园等。在过去20年中，黑鹳的饲养繁育技术不断取得突破，种群已经进入平稳增长阶段。

然而，随着种群的增长，种群管理的重要性逐渐凸显出来。2011年中国动物园协会物种保护委员会专门成立黑鹳保护委员会，并建立了黑鹳的谱系簿。根据谱系记录，目前种群建群者22只，潜在建立者38只。种群发展早期因为专注于繁殖成功率，园际种源调配开展的较少，各个动物园的种群总体上呈现相互隔离、近交的状态。到2017年底，近交系数平均0.034 4，建群者遗传多样性保存量为19.36。按照目前的种群状况，基因多样性保持在90%以上，仅能维持13年。因此，当前最为迫切的是解决遗传管理问题，以保持种群的质量和遗传多样性。

当前种群的遗传管理需要解决如下几个问题：第一，谱系的确证和勘误。当前的谱系是根据动物园中原始记录整理而成，而人工记录难免有疏失、遗漏甚至错误。这类原始资料的错误是无法矫正的。因此，需要建立一些新的方法来矫正这些错误，并在后续的谱系续写中确保信息正确。第二，建群者之间的实际关系在当时是不清楚的，因此作为无关个体对待。这样，谱系本所有的遗传统计都有可能存在偏倚，影响管理决策。第三，黑鹳体色不太丰富，个体识别信息较少，从出生到长成的变化往往影响对个体的准确识别，形成谱系的错误来源。第四，群体遗传学统计中，基于谱系本的统计仅是表观统计值，受信息误差的影响大，需要更加精准的分析工具和统计方法来支持精准管理。

基于DNA的分子遗传学分析能够提供更为精准的遗传信息，是精准管理的重要工具。微卫星(microsatellites)是基因组上短串联重复序列，因重复次数不同而呈现出高度多态性，因其突变率高、分布广泛且均匀、多态性高、共显性标记、选择中性、易检测、分型重复性好、取样范围大、统计方法多样等优点，在群体遗传研究、亲缘鉴定等方面得到了广泛的应用，涵盖了水产、家禽家畜、粮食作物、实验动物、稀有物种、昆虫等各个研究领域[32-36]。

传统的微卫星多态性分析依靠PCR技术。但是，作为引物区的微卫星侧翼序列在不同的物种之间有可能相同，也可能不同。因此，同一个微卫星位点有时表现出近缘物种间的通用性，有时也表现出物种的特异性。根据这一特点，从近缘物种的微卫星中能够筛选到目标物种的微卫星[35-36]。相比构建文库从头筛选，这是一种低成本的策略。

目前为止，尚未有黑鹳微卫星的报道，为了解决黑鹳人工饲养种群的上述管理问题，本研究通过对黑鹳近缘物种微卫星位点中筛选了适合于黑鹳的位点，并针对我国当前黑鹳人工饲养种群进行了群体遗传特征的分析，探究其在黑鹳种群中的适用性。

1 材料与方法

1.1 样品及总DNA提取

在北京动物园的协助下，从保定动物园和太原动物园共采集了72只黑鹳个体。在2017年11月对黑鹳进行疫苗注射的同时，在翅下静脉取静脉血约0.5 mL，置于1.5 mL离心管中，以EDTA-Na2抗凝(终浓度1.5 mg/mL)，放在冰盒中预存。血液样品运到实验室后，每个样品取5滴(约100 μL)均匀滴在DNA血样采集卡上，避光静置，干燥后置于阴凉处保存备用。采用AxyPrep基因组DNA小量试剂盒(Axygen，抗州)提取总DNA。用NanoPhotometer-N50紫外分光光度计(Implen，Germany)测定DNA浓度，统一稀释至10 ng/μL左右，4℃存放备用。

1.2 PCR扩增

本研究采用近缘物种交叉扩增的方法获得黑鹳微卫星。根据GenBank中已报道的微卫星位点，结合黄赟[37]、张伟[36]、Wang[38]、Shephard[39]、Tomasulo-seccomandi[40]等人的文献，选取白鹳(Ciconiaciconia)、东方白鹳(Ciconiaboyciana)、林鹳(Mycteriaamericana)和大蓝鹭(Ardeaherodias)4个物种中，扩增效果较好的29个微卫星共30对引物(表1)，以黑鹳DNA为模板进行扩增。在所有位点的上游引物5′端均加入一段M13序列(5′-GGAAACAGCTATGACCAT-3′)[41]，同时，单独合成M13接头序列并加上Fam荧光标记。所有引物及接头序列均由哈尔滨擎科生物公司(TSINGKE)合成。PCR扩增采用北京全式金公司(TransGen Biotech)生产的TransStart TopTaq DNA Polymerase，扩增采用15 μL体系(表2)。所有位点的PCR扩增程序为：94℃/4 min，(94℃/30 s，Ta/40 s，72℃/30 s)×30 cycles，72℃/5 min。扩增产物经过1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，扩增效果PCR产物用ABI3100型遗传分析仪进行毛细管电泳检测。

1.3 基因分型

毛细管电泳得到的是微卫星等位基因扩增片段的观测值[42]，利用毛细管电泳的这一特性，对各个微卫星位点进行初步分型。毛细管电泳检测的结果用GeneMapper软件读取，获得毛细管电泳的峰图和每个信号峰的片段长度。按照来源物种重复单元的提示信息，将片段长度转换为等位基因。等位基因数据输入Excel表格后，导入Cervus 3.0中，分析各个位点的等位基因数(NA)、观测杂合(Ho)度、期望杂合度(He)和多态信息量(PIC)等信息。

2 结果

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，共18个位点有明确的符合微卫星片段大小的扩增产物，占筛选位点总数的60%。其余位点或是难以出现清晰条带，或是杂带过多而影响后续的毛细管电泳结果分析，亦或是扩增条带过大(>500 bp)，难以判断是否为微卫星产物。

毛细管电泳显示，在上述18个位点中，Cc01位点的峰值过低，干扰峰过多，无法对其基因型进行准确的判断，故舍弃。其余位点均有明确的，符合预期的等位基因扩增产物，但是，Cc05、Cc06、WSμ13、WSμ14、Cbo102、Cbo121、Cbo133、Cbo151、Cbo168和Ah208都只有一个等位基因。其余7个位点Cc02、Cc03、Cc04、Cc07、Cc10、Cc37和Cc42有2—8个等位基因，占可扩增位点的35.3%(表1)。

Cc03、Cc37和 Cc42各发现2个等位基因，多态信息含量(PIC)仅有0.211—0.375，在群体分析中所能提供的遗传信息较少。Cc02有4个等位基因，PIC为0.497，He为0.561，可以提供较多的遗传信息。Cc04、Cc07、Cc10 3个位点的等位基因数(NA)在7—8个，PIC分别为0.518、0.731和0.784。在当前群体中，Cc02、Cc04、Cc07、Cc10都符合H-W平衡(P=0.088—0.601)，说明等位基因频率分布比较符合随机交配，为群体遗传学指标的计算提供更多、更可靠的信息。

表1 微卫星位点信息Tab.1 Information of microsatellites selected for cross amplification in the black stork Ciconia nigra

续表1

注：“*”表示重复单元之间含有一个碱基；“+”表示两个重复单元之间存在几个随机碱基；a和b表示同一个位点的不同引物；PIC一列中，“()”中的数字表示等位基因个数；“—”表示数据未知；未标明出处位点的均来自GenBack
Note：“*” stands for repeating motif interrupted by a single nucleotide.“+” stands for repeating motif interrupted by several random nucleotides.“a” and “b” stand for one locus has different primers.In thePICcolumn，the figures in “()” stands for allele.“—” stands for the date unknown.the locus that are not marked are from GenBack

表2 微卫星PCR扩增体系Tab.2 Components of PCR system of microsatellites

3 讨论

微卫星的侧翼序列具有保守性，这是近缘物种间微卫星位点交叉扩增的基础。鸟类研究中，采用近缘种交叉扩增来筛选和使用微卫星在鸡形目(Galliformes)和雀形目(Passeriformes)比较集中[37]。特别是鸡形目，得益于家鸡的全基因组序列的成功测序和注释，有超过900个微卫星位点被发现和分析[35]，为鸡形目其他物种的微卫星交叉测试和遗传管理应用提供了极大地便利。然而，鹳形目鸟类的基因组始终没有测定，报道的微卫星主要是通过建库和探针筛选获得的，总体数量非常有限，因此，对于黑鹳可借用的位点数就更少了。

本文从白鹳、东方白鹳、林鹳、大蓝鹭4个物种中，选择多态性好、扩增效果稳定的29个微卫星位点，测试在黑鹳的可用性。结果显示，同属的物种，微卫星扩增成功率和多态性均高于关系较远的物种。比较表1和表3可知，白鹳微卫星有69.2%(9/13)能够在黑鹳成功扩增，53.8%表现出多态性(NA≥2)，同属的东方白鹳的微卫星有71.4%(5/7)能够在黑鹳成功扩增，但无一具有多态性。在林鹳和大蓝鹭这两个系统关系较远的物种，微卫星在黑鹳成功扩增率分别为33.3%和25.0%，但成功扩增位点均无多态性。

这表明一种趋势，近缘种基因组序列相似度高，微卫星成功交叉扩增的概率高，而远缘种之间情况则相反。但是交叉扩增成功率与多态性没有必然的联系，而是取决于不同物种进化历史的相似性。微卫星是基因组上非常活跃的组件，所发生的进化事件会灵敏的反应在多态性上，不同物种经历的进化事件不同，同一个位点，即使侧翼序列没有变化，但多态性上会有显著不同。这就为采用交叉扩增来获得微卫星位点构成风险。

尽管如此，本研究还是筛选到4个可用的黑鹳微卫星位点，分别是Cc02、Cc04、Cc07、Cc10，这些位点扩增效果稳定，多态信息含量高，等位基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡，可作为黑鹳群体遗传学分析和遗传管理之用。

表3 17个微卫星位点在人工饲养黑鹳种群中的遗传特点*Tab.3 Characteristics of 17 microsatellites in the captive black stork Ciconia nigra population*

续表3

*注：Cc01位点的峰值过低，干扰峰过多，无法准确分型，故舍弃
*Note：Cc01 was discarded due to low target signals and complex untargeted signals that risk genotyping