红棕杜鹃（原变种）叶提取物体外抗3种皮肤真菌活性的研究

莫 全 杨勇勋

（西昌学院动物科学学院，四川西昌 615000）

皮肤癣菌病是由皮肤癣菌引起的毛发、皮肤和指（趾）甲的浅部感染，其发病率和复发率均较高，并可以在动物之间、动物与人之间传播，造成严重的公共卫生问题，且部分属为亲动物性皮肤癣菌，特别是须毛癣菌、犬小孢子菌和石膏样小孢子菌对犬、猫有重要意义，可引起斑状脱毛癣、轮状脱毛癣、水疱性和结痂性脱毛癣、毛囊炎[1]。临床上表现极度瘙痒，脱毛形成鳞屑、毛囊破裂、溃疡性及结节性皮炎、指甲干燥开裂质脆且变形，3种真菌均为人蓄共患病原，人由接触感染的犬、猫而被传染，用西药进行治疗价格相对较贵，并具有一定的毒副作用，临床上现有的抗真菌药物如两性霉素B、唑类抗真菌药等在高效低毒、抗真菌谱和耐药性方面评价尚不太令人满意。真菌感染的治疗受到药物安全性、真菌耐药性及药物效能等方面的局限[2]，因此急需研发有效的、安全无毒的、纯天然的、对环境友好的植物源抑真菌剂替代化学药剂，有利于治愈各种顽固性真菌疾病。

杜鹃花（Rhododendron simsii Planch），又称山踯躅、山石榴、映山红，全世界的杜鹃花约有900种，中国杜鹃花种类多、分布广，四川凉山地区杜鹃花科植物种类多，分布范围广，物种资源丰富，且凉山红棕杜鹃（原变种）还具有一些其他中医药不具备的独特功能，部分种类还为特殊种[3]。目前对于杜鹃花的研究主要集中于止咳、平喘、治疗慢性支气管等疾病，据资料记载杜鹃花毒素具祛风除湿，降低血压，减慢心率的功效[4]，对于红棕杜鹃（原变种）对皮肤真菌的治疗暂无记录，属于研究的空白。从植物与微生物中研究新的生物天然抗真菌物质是当前开发、研制新型杀菌剂的热点之一，现阶段有关植物提取物对抗皮肤真菌的研究不多，但植物仍被认为是化学药剂最好的替代品，Wilkins等（1989）曾报道有1389种植物有可能作为杀菌剂[5]，植物中的抗毒素、类黄酮、有机酸以及酚类化合物均具有杀菌或抗菌活性，而杜鹃花（原变种）中富含黄酮等酚酸类成分，因此将红棕杜鹃（原变种）提取物作用于皮肤真菌的研究与开发具有很高的价值。

1 材料

1.1 试验菌种

犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、须毛癣菌三种皮肤真菌，由西昌学院攀西动物疫病检测与防控重点实验室提供。

1.2 材料与试剂

红棕杜鹃（原变种）叶2016年6月采集于凉山州昭觉县七里坝，经西昌学院动物科学学院杨勇勋副教授鉴定。葡萄糖、琼脂、蛋白胨、95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、蒸馏水、正丁醇、二甲基亚砜、石蜡，以上药品均由西昌学院动物科学学院实验室提供。

2 方法

2.1 药物制备

2.1.1 红棕杜鹃（原变种）叶各提取物的制备

将采集的凉山红棕杜鹃（原变种）叶1kg，用清水冲洗两遍并用蒸馏水冲洗两遍，自然条件下通风干燥后，用电动粉碎机粉碎成粉末，室温下用95%的乙醇、乙酸乙酯、石油醚分别浸泡两次，每次约24h，浸泡完成后用旋转蒸发器回收溶剂，分别得到乙醇、乙酸乙酯、石油醚浸剂提取物，各取20g提取物标记备用[6]。

2.1.2 红棕杜鹃（原变种）叶乙醇提取物各萃取相的制备

乙醇提取物除部分直接用于活性测定外，余者全部混悬于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇按3比1的比例进行萃取。萃取液分别经旋转蒸发器后，分别得到石油醚相浸膏、乙酸乙酯相浸膏、正丁醇相浸膏，各取20g浸膏标记备用[7]。

2.1.3 红棕杜鹃（原变种）叶各提取物及乙醇提取物各萃取相溶液的配制

取红棕杜鹃（原变种）叶乙醇、乙酸乙酯、石油醚粗提液及乙酸乙酯相、石油醚相、正丁醇相浸膏各2g，然后用水及适量的二甲基亚砜配制成浓度为1g/L的药液，做好标记供生物活性测定时使用。

2.2 抗菌活性试验

准确吸取1.5ml药液加入到13.5ml融化的沙氏培养基中（50℃左右），混匀后倒入灭菌的培养皿（直径9.0cm）内，制成含药培养基平板，不同含药培养基平板做好标记，对照混入相同体积的二甲基亚砜与水混合物加入到13.5ml融化的沙氏培养基，混合均匀后倒入规格一致的灭菌培养皿内，制成不含药培养基平板，作为空白对照组[8-9]。在已培养4～5d的供试菌平板上，用直径为0.4cm的打孔器制成若干菌饼，用接种环挑取菌饼分别轻放于含药培养基和非含药培养基平面上（有菌丝的一面朝下），每个培养皿放置两个菌饼，每组重复3次，25℃霉菌培养箱培养一周后测定各试验组的菌落直径。

2.3 计算红棕杜鹃（原变种）叶提取物抑菌率

按下式计算红棕杜鹃（原变种）叶提取物对供试菌的菌丝生长抑制率。

2.4 数据的统计分析

采用SPSS 20. 0 软件对数据进行整理，并进行单因素方差分析和多重比较，结果以“平均值±标准差”表示。

3 结果与分析

3.1 红棕杜鹃（原变种）叶乙醇、乙酸乙酯、石油醚粗提液抗3种皮肤真菌活性结果

从表1可以明显看出不同极性的有机溶剂所得杜鹃（原变种）叶粗提液对3种皮肤真菌均有抑制作用，且抑制效果差别明显，乙酸乙酯粗提液抑菌效果最佳，对石膏样小孢子菌、犬小孢子菌和须毛癣菌抑菌率分别为43.3%、49.3%、53.6%，石油醚粗提液抑菌效果最差，对抑菌率分别为28.3%、29.6%、32.4%。

表1 红棕杜鹃（原变种）叶乙醇、乙酸乙酯、石油醚粗提液抑菌率

3.2 红棕杜鹃（原变种）叶乙酸乙酯相、石油醚相、正丁醇相抗3种皮肤真菌活性结果

从表2可以观察出红棕杜鹃（原变种）叶各萃取相对3种皮肤真菌均有不同程度的抑制作用，对犬小孢子菌来说，乙酸乙酯萃取相抑菌效果最佳，抑菌率为42%，正丁醇萃取相抑菌效果最弱，抑菌率为18.5%。

表2 红棕杜鹃（原变种）叶乙酸乙酯萃取相、石油醚萃取相、正丁醇萃取相抑菌率

以上结果表明红棕杜鹃（原变种）叶提取物对于3种皮肤真菌均有抑制作用，经95%乙醇浸泡后正丁醇萃取所得的粗提液抑菌效果最差，乙酸乙酯粗提取液抑菌效果最佳，根据相似相溶的原理，红棕杜鹃（原变种）叶的抗真菌成分主要存在于乙酸乙酯当中。

4 结果与讨论

皮肤癣菌可分为亲动物型与亲人型，均可直接或间接引起人的皮肤癣菌病，潮湿、温暖、不洁、拥挤的环境是造成皮肤癣菌病的主要因素，皮肤癣菌病呈世界性分布，且对动物特别是犬、猫皮肤造成了重要伤害[10-12]。植物源药物由于不易产生耐药，是当前抗菌药物研究的热点，现阶段对于通过植物源药物治疗皮肤真菌的记录逐年增加，如科学家已通过提取洋葱、竹、大蒜、大葱、韭菜及若干种中药中的有效成分作用于皮肤真菌，且研究结果表明有抑制作用[13]。目前杜鹃（原变种）叶的研究前景主要集中于扦插繁育方面，关于治疗皮肤真菌暂无记录。植物粗提取物成分复杂，通过不同的提取方法、提取溶剂可得到不同的有效成分，药理作用复杂，抗真菌成分也多样，并且受各种因素影响，因此对于植物源药物的开发与研究需要深入且系统地研究[14]。

本试验用不同极性的红棕杜鹃（原变种）叶提取物及萃取相对犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和须毛癣菌三种皮肤癣菌进行体外抗真菌活性的研究，试验结果显示红棕杜鹃（原变种）叶具有抑菌作用，在同一种有机溶剂中，浸泡所得粗提液抑菌效果优于萃取相；同种提取方法中，乙酸乙酯粗提取液效果较好，乙醇粗提取液效果次之，石油醚粗提取液效果最弱。杨勇勋等人从红棕杜鹃（原变种）乙酸乙酯粗提液中分离纯化得到的植物单体─东莨菪内酯[15]，研究表明该单体主要存在于红棕杜鹃（原变种）当中，具有良好的杀虫、抗菌杀菌、杀螨、化感等生物活性[16]，这与本次试验当中乙酸乙酯粗提液抗皮肤真菌效果最佳的结果相一致，且提示试验中主要的抗真菌成分可能为东莨菪内酯，说明从红棕杜鹃（原变种）中提取抗真菌活性药物具有研究价值。此次试验结果为植物源抗菌药物的研发提供了一定的参考价值，但杜鹃（原变种）叶中具有抗真菌作用的具体成分是什么，何种提取溶剂何种提取方法所得提取物的何种浓度的抑菌效果最佳，还需要进一步研究和开发利用。