基于离子迁移谱的肌酐检测研究

高晓光何秀丽贾建李建平

(1.中国科学院电子学研究所传感技术国家重点实验室，北京100190；2.中国科学院大学，北京100049)

肌酐是人体肌肉组织代谢的产物。肌肉中肌酸主要通过不可逆的非酶脱水反应缓慢形成肌酐，再释放到血液中。血清肌酐(Serum creatinine，Scr)与体内肌肉总量关系密切，不易受饮食影响。人体中的肌酐主要由肾小球滤过排出体外。在正常条件下，肌酐浓度相对稳定，当肾脏机能受到损伤时，肌酐的正常排泄功能受到一定阻碍，Scr浓度升高。肾功能正常者的Scr浓度小于133 μmol/L，而尿毒症患者的Scr浓度一般大于707 μmol/L。Scr浓度是临床上计算肾小球滤过率(glomerular filtration rate, GFR)，评价肾功能的重要指标。检测Scr对慢性肾脏病等疾病的发现和治疗具有重要意义[1]。

临床上主要通过碱性苦味酸法和酶法(包括肌氨酸氧化酶法与肌酐亚胺水解酶法)测定Scr[2, 3]，碱性苦味酸法成本低廉，但特异性不强，抗干扰能力差；肌氨酸氧化酶法准确度、抗干扰能力均优于碱性苦味酸法，并且交叉污染较少，适用于全自动生化分析仪，但检测成本较高，测得的Scr值容易受到血管保护剂类药物羟苯磺酸钙和维生素类药物维生素C等的干扰[4 - 6]。我国于2013年颁布了卫生行业标准《血清肌酐测定参考方法. 同位素稀释液相色谱串联质谱法》(WS/T413—2013)，规定同位素稀释液相色谱串联质谱法为Scr测定的标准方法[7]。除此之外，肌酐检测方法还包括毛细管电泳法、高效液相色谱法、拉曼散射法等，但这些不适合大规模现场检测，只适合实验室中校准对照或高精度检测[3]。

离子迁移谱(Ion Mobility Spectrometry，IMS)基于不同气相离子在电场中迁移速度的差异实现对化学物质的分离检测。与其它方法相比，IMS具有分析速度快、检测限低、不需要真空环境等优点[8]。IMS已被广泛应用于人体健康检测研究中，如许多研究人员使用IMS检测人体呼出气体或尿样、血样中的特定组分，区分某些疾病患者与健康人，实现疾病的早期发现与诊断[9]。

本实验使用实验室自制的电晕放电离子迁移谱(CD-IMS)系统进行肌酐检测研究，根据IMS图谱中被测物特征离子峰强度实现对肌酐的定量测量，并探讨了羟苯磺酸钙、维生素C等药物对肌酐IMS检测的干扰。

1 实验

1.1 实验试剂与材料

肌酐(CAS：60-27-5)：99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；羟苯磺酸钙(CAS：20123-80-2)：99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；维生素C(CAS：50-81-7)：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；封口玻璃毛细管：内径0.9～1.1 mm，壁厚0.10～0.15 mm，管长100 mm，华西医科大学仪器厂；去离子水：电阻率18.2MΩ·cm。

1.2 离子迁移谱实验系统及原理

图1为CD-IMS实验系统结构示意图。整个系统由漂移管和维持漂移管正常工作的辅助设备组成。

图1 CD-IMS实验系统结构示意图

漂移管为CD-IMS实验系统核心部件，主要包括离化区和漂移区两部分，两者由Bradbury-Nielson型离子门隔开。漂移管由不锈钢漂移环和聚四氟乙烯绝缘环交替重叠组成，漂移电压通过电阻分压后加在各漂移环上，在漂移管内形成均匀漂移电场。漂移管末端为法拉第盘，用于离子流信号收集检测。在漂移管前端离化区入口处的不锈钢电晕针与漂移管第一级漂移环构成“针-环”结构的电晕放电电离源。在离化区入口处另有通孔分别作为进样口与漂移气出口。

辅助设备包括温控模块、漂移气路、离子流信号放大与数据采集处理装置以及用于电离源及漂移电场的高压电源等。漂移气路包括空气源(A-10型，北京中惠普分析技术研究所)、干燥净化管以及管路。空气源产生的洁净空气经活性炭与分子筛干燥净化后从法拉第盘周围导入漂移管作为漂移气体。整个漂移管置于恒温装置中，由温控模块调控漂移管工作温度。受材料限制，漂移管最高工作温度为200℃。

被测物分子在离化区与空气电晕放电产生的反应离子相互作用生成被测物特征离子，通过离子门进入漂移区，然后在电场作用下漂移到末端法拉第盘。pA级的离子流信号经放大后转换为数字信号并上传到上位机，由上位机实现IMS谱图的显示、分析及存储。通过IMS谱图中离子峰的变化确定被测物特征离子峰，进而实现对被测物的定性定量检测。

IMS实验系统的主要参数如表1所示。

表1 CD-IMS实验系统主要参数

1.3 实验方法

使用电子天平(GR-202型，日本AND)称量一定量肌酐固体，溶于去离子水中得到1 g/L(8840 μmol/L)的肌酐母液，之后取母液用去离子水按照一定比例稀释即可得到一系列浓度的肌酐样品。

将封口玻璃毛细管加热，用移液器移取2 μL肌酐样品，在封口玻璃毛细管冷却过程中沿开口端注入封口玻璃毛细管中。由于气体热胀冷缩，肌酐样品完全进入毛细管中，进样时将封口玻璃毛细管开口端沿进样口插入IMS系统，避免了样品与进样口内壁接触造成损耗和污染。实验发现玻璃毛细管的插入位置及漂移管温度会对实验结果造成影响，通过参数优化确定最优的玻璃毛细管进样位置和漂移管温度。

采集从进样到产物离子峰消失全过程的IMS谱图，根据谱图中肌酐特征离子峰的漂移时间计算肌酐的约化迁移率。为减小漂移气以及环境中的痕量杂质对实验的影响，采用肌酐响应图谱与空白谱的差分谱中肌酐特征离子峰最大高度作为IMS对肌酐响应的信号强度。检测不同浓度肌酐样品，得到肌酐的响应—浓度曲线、线性范围与检测限。

采用同样方法配制羟苯磺酸钙与维生素C样品并进行IMS检测，获得高浓度羟苯磺酸钙与维生素C样品的IMS谱图；分别配制肌酐与羟苯磺酸钙、维生素C的混合样品，研究羟苯磺酸钙与维生素C对肌酐IMS检测的干扰情况。

2 结果与讨论

2.1 肌酐的IMS检测图谱

图2为空白图谱及4.42 μmol/L肌酐样品CD-IMS检测时得到的系列谱图，其中(a)为空白谱图，(b)、(c)和(d)分别为进样后8s、62s、79s的谱图。

图2 空白图谱及肌酐的系列CD-IMS谱图(a).空白谱 ；(b).进样后8s；(c).进样后62s；(d).进样后79s漂移管温度：200℃ ； 进样距离：5cm

图2(a)空白谱图中，RIP1，RIP2，RIP3为反应物离子峰，利用四丁基溴化铵标定[10]后计算其约化迁移率分别为3.09cm2·V-1·s-1，2.69cm2·V-1·s-1和2.40cm2·V-1·s-1，可知其分别为(NH4)+(H2O)n，(NO)+(H2O)n和(H3O)+(H2O)n，其中n的数值与漂移气中的水含量及漂移管温度有关[11]。

将玻璃毛细管插入进样口之后，由于肌酐的沸点(184.3±23.0℃)较高，而且常温下蒸汽压很小(25℃时0.2±0.8 mmHg)，在漂移管高温作用下样品中水首先汽化，漂移气体中水含量增加，导致IMS谱图中RIP1离子峰增大，RIP2离子峰减小直至消失。在水的汽化过程中(持续时间约55～60s)，漂移管中水汽浓度基本维持不变，IMS谱图也保持如图2(b)所示基本不变。

样品中水完全汽化后，肌酐通过蒸发或升华过程逐渐变成气体，在IMS图谱中出现漂移时间为11.04ms的新离子峰，如图2(c)所示。同时由于漂移气体中水汽含量降低，RIP2峰重新出现。比较相同条件下去离子水的IMS谱图，可以知道漂移时间为11.04ms的离子峰为肌酐特征离子峰。由于肌酐分子中含有易于结合质子的胺类官能团，易与质子结合形成[M+H]+(m/z 114)的分子离子[12]，推测图2(c)中肌酐的特征离子为质子化的水合离子[M+H]+(H2O)n，计算其约化迁移率为1.83cm2·V-1·s-1，与文献[13]报道的约化迁移率(1.86～1.89 cm2·V-1·s-1)基本一致。

样品中肌酐完全变为气体后，在漂移气的清洁作用下离化区中肌酐浓度逐渐降低，其特征峰强度逐渐降低，到79s左右时基本消失，谱图见图2(d)。

2.2 IMS漂移管温度及玻璃毛细管进样位置优化

不同漂移管温度下4.42 μmol/L肌酐的CD-IMS信号强度如图3所示。

图3 不同漂移管温度下肌酐CD-IMS信号强度进样距离：5cm

可以看出在160℃到200℃范围内，肌酐信号强度随漂移管温度的提高而逐渐增大。这主要是因为高的漂移管工作温度有助于肌酐的快速蒸发或升华，从而在离化区获得更高浓度的肌酐气体及更大的响应信号。下文实验中漂移管工作温度保持为200℃。

玻璃毛细管的进样位置(玻璃毛细管开口端插入进样口的距离)对肌酐的CD-IMS信号强度有较大影响。图4是不同玻璃毛细管进样位置下肌酐的CD-IMS信号强度。当玻璃毛细管进入进样口深度小于5cm时，毛细管开口位于CD电晕针尖前方(电晕针尖与漂移气出口之间)，样品中的大部分肌酐分子在漂移气作用下被直接吹出漂移管，未能形成离子，导致肌酐特征峰信号很小。当玻璃毛细管进入进样口深度为5cm时，毛细管开口处与CD电晕针尖基本齐平，在CD放电区域可以获得较高的肌酐分子浓度，从而得到较大的肌酐信号。当玻璃毛细管进入进样口深度超过5cm时，玻璃毛细管开口处位于CD电晕针后方(电晕针与第一级漂移管之间)，毛细管外壁积累的表面电荷对电晕放电产生较大影响；而且毛细管开口处与CD电晕针尖距离增大也导致放电区域肌酐分子浓度降低，这些都导致了肌酐信号的减小。

图4 不同玻璃毛细管进样位置下肌酐CD-IMS信号强度漂移管温度：200℃

2.3 肌酐样品的IMS检测

配制一系列浓度的肌酐样品，在优化后的工作参数下对每个浓度样品进行12次检测，得到肌酐的CD-IMS响应-浓度曲线如图5所示。

图5 肌酐CD-IMS响应-浓度曲线

肌酐在0.88 μmol/L ～ 8.80 μmol/L范围内线性回归方程为y=0.03874x+0.00712，相关系数R2=0.98，基于3倍噪声计算的检测限(Limit of Detection，LOD)为0.087 μmol/L，远低于健康人的Scr值。

2.4 羟苯磺酸钙和维生素C对肌酐检测的影响

图6为羟苯磺酸钙、维生素C样品以及它们与肌酐混合样品的CD-IMS谱图，其中(a)、(b)分别为高浓度羟苯磺酸钙与维生素C样品的CD-IMS谱图，而(c)、(d)为肌酐分别与羟苯磺酸钙、维生素C混合样品的CD-IMS谱图。

图6 羟苯磺酸钙、维生素C以及与肌酐混合样品的CD-IMS谱图(a).4780 μmol/L羟苯磺酸钙；(b) .567 μmol/L维生素C；(c).4.42 μmol/L肌酐 +1.20 μmol/L羟苯磺酸钙；(d). 4.42 μmol/L肌酐 + 4.19 μmol/L维生素C

由图6(a)可见，羟苯磺酸钙IMS图谱10.74ms处出现一强度较弱的特征峰，其约化迁移率为1.88 cm2·V-1·s-1，与肌酐的约化迁移率不同。图6(b)维生素CIMS图谱在12.19 ms处有一较弱特征峰a，12.80ms处有一较强特征峰b，约化迁移率分别为1.66 cm2·V-1·s-1和1.58 cm2·V-1·s-1，均与肌酐的约化迁移率不同。维生素C具有较强的还原性，其水溶液不稳定，容易被氧化成脱氢维生素C，在正离子模式下的IMS谱图中可见较强的特征离子峰。

图6(c)、(d)样品分别为4.42 μmol/L肌酐和1.20 μmol/L羟苯磺酸钙混合溶液、4.42 μmol/L肌酐和14.19 μmol/L维生素C混合溶液。这是因为根据文献[4]报道，当按照建议剂量服用羟苯磺酸钙药品时，体内血清羟苯磺酸钙浓度将会稳定在15 mg/L(35.85 μmol/L)以下，其浓度量级与Scr相当。正常人体血浆中维生素C含量在4mg/L(9.56 μmol/L)以上，其浓度量级同样与Scr相当。从图6(c)、(d)可以看出混合样品的谱图中除了肌酐的特征离子峰和反应物离子峰外，没有出现其它明显的干扰峰。

对两种混合样品分别进行6次重复检测，与肌酐样品的CD-IMS响应信号进行比较。4.42 μmol/L肌酐样品的IMS信号强度为0.183±0.019 a.u.，肌酐与羟苯磺酸钙混合样品的IMS信号强度为0.163±0.046a.u.，与肌氨酸氧化酶法相比本方法中羟苯磺酸钙对肌酐检测的负干扰较小；肌酐与维生素C混合样品的IMS信号强度为0.175±0.016a.u.，与肌酐样品信号强度基本相当，可见维生素C对于肌酐的IMS检测影响很小。

肌酐的肌氨酸氧化酶检测法是通过检测肌酐在酶作用下降解产生的H2O2浓度来确定肌酐浓度，羟苯磺酸钙、维生素C等可消耗H2O2，从而对肌酐检测产生负干扰。而在IMS检测方法中，由于肌酐含有胺类官能团，很容易形成正离子，羟苯磺酸钙、维生素C等对肌酐与反应离子之间的分子离子反应影响较小，从而对肌酐的IMS检测干扰较小。IMS可作为肌氨酸氧化酶法的补充用于肌酐检测。

3 结论

利用自制CD-IMS系统实现对肌酐样品检测，线性范围0.88 μmol/L～ 8.80 μmol/L，基于3倍噪声的检测限为0.087 μmol/L。对肌酐和羟苯磺酸钙、维生素C的混合样品检测实验证实羟苯磺酸钙、维生素C对肌酐的IMS检测影响很小。IMS方法操作简便，在肌酐的快速检测方面具有良好的应用前景。