子宫内膜容受性判断新进展

仇嘉昕，高玉平

(上海交通大学医学院附属新华医院生殖中心，上海 200000)

辅助生殖技术预后的改善主要包括胚胎质量的优化以及植入胚泡与子宫内膜同步性的提高，各种促排卵和黄体支持技术的发展也是为了使子宫内膜达到更接近自然妊娠植入期的状态。现在辅助生殖技术能够通过控制性超排卵获得多个胚胎并从中选择优质胚胎进行移植，但研究显示即使是评分≥3 BB的优质囊胚，临床妊娠率与持续妊娠率都分别只有44%和41%[1]，主要原因是子宫内膜受损或者未处于“种植窗口期”[2]。全胚胎冷冻技术问世后，研究者们发现，有排卵的不孕妇女中移植冻胚与鲜胚的活产率并无统计学差异[3]，这说明冷冻技术不仅没有影响胚胎的活力，反而为胚胎与子宫更好的同步性创造了条件。胚胎植入前子宫内膜容受性的判断经历了从形态学、影像学到分子生物学，从侵入性检查到无创性操作的发展过程，本文就胞饮突、影像学、分子生物标志物等经典子宫内膜容受性判断指标的最新进展作一综述。

一、胞饮突

胞饮突是人类的着床期子宫内膜表面微绒毛融合成的花状膜突出物，其形态的变化根据扫描电镜影象可分为发育中、发育完全、衰退3个阶段；其数量及形态都与胚胎成功种植密切相关。

由于胞饮突在子宫内膜黄体期持续存在，仅凭单纯的胞饮突计数并不能精确描述胚胎种植窗口期[4]。近年来检测胞饮突各形态比例作为一种无创的检查方式重新受到生殖学家的关注。在一项前瞻性队列研究中，172位参与者中有46位参与孕激素治疗3～7 d后的胞饮突计数研究；余下126位参与孕激素开始治疗后第6天胞饮突计数与妊娠结局关系的关系研究。结果显示胞饮突总数在第6天达到最高峰，而发育中胞饮突的比例在第6天最低(平均值为49.40)，完全发育胞饮突的比例在第4天(平均值14.07)到第5天(平均值34.27)迅速上升并在第6天(平均值46.91)达到峰值；第二组实验中妊娠与未孕妇女的年龄、内分泌状态、优质胚胎率均无统计学差异，而成功妊娠者的胞饮突有着明显更高的完全发育比例与更低的发育中比例(P均<0.05)。由此Jin等[5]提出胞饮突指数的概念：每一点发育完全胞饮突(FDP)百分数计1分，每一点发育中的胞饮突(DP)百分数计-1分，该实验中妊娠妇女与未孕妇女胞饮突指数分别为(-2.11±2.84)和(-18.69±5.82)(P=0.006)，且低胞饮突指数(<-26.48)有着显著的预后价值，相对于正常胞饮突指数妊娠率更低(53.3% vs.82.3%)。因此基于优化计数方法的胞饮突测定可以反映内膜状态，与冷冻胚胎移植后成功妊娠率相关性显著。

通过制作胞饮突计数与累积临床妊娠率受试者工作曲线ROC，另一项随机对照研究找到胞饮突计数的最佳截断值为85(敏感性74.7%，特异性93.1%)。根据胞饮突计数分类，正常患者(计数>85)的临床妊娠率与持续妊娠率在第一次周期中都更高(分别为74.29% vs.19.77%和 62.86% vs. 11.86%)(P均<0.001)。尽管胞饮突完全不表达并不意味着绝对不孕，但这部分患者的流产率与反复移植失败率更高，且根据胞饮突检查个体化移植的妊娠率远高于传统胚胎移植(33.82% vs.8.11%，P=0.004)，因此在反复移植失败患者群体中检查胞饮突具有重要的意义[6]。

二、超声学检测

一般超声从子宫内膜厚度、内膜回声类型、内膜蠕动、容积超声、内膜及内膜下血供等方面对子宫内膜容受性进行评价。通常认为HCG注射当日内膜类型为三线型(A型)、移植日内膜蠕动呈低频次正向运动或相对静止型(蠕动波频率<3 次/分)时，妊娠率相对更高，而当内膜容积小于2.5 cm3时临床妊娠率明显下降[7]。最佳着床内膜厚度尚存争议，单纯厚度不能量化其功能，对IVF结局预测价值较低[8]。但一般都认为种植当日子宫内膜厚度至少需要7 mm[9-10]。

最新大样本回顾性队列研究显示，当内膜厚度<7 mm时活产率更低，新生儿体重更轻[11]。提高子宫内膜厚度对妊娠结局和新生儿预后都具有积极意义。中华医学会生殖分会在2018年就提出需要对<7 mm的薄型子宫内膜进行大剂量雌激素、仿生物电刺激、细胞集落刺激因子等联合治疗方案[12]。

血管生成在胚胎植入过程中扮演着重要角色，刺激血管生成药物的应用可以提高辅助生殖预后[13]。血流动力学参数方面，子宫螺旋动脉可能比子宫动脉有着更高的参考价值。研究显示，反复流产患者中，非妊娠组的子宫螺旋动脉搏动指数PI、阻力指数RI、血流速度收缩期峰值/舒张期峰值(S/D)均与妊娠组存在统计学差异[14]。

单一的超声指标对内膜容受性的预测价值有限，如何联合多种超声参数综合评价内膜状态还需不断探索。近年来，靶向分子超声成像有望成为预测子宫内膜容受性的新方向。这项技术将目的分子特异性抗体或配体连接到声学造影剂表面构筑靶向声学造影剂，使声学造影剂主动结合到靶区，进行特异性的超声分子成像，这样可以以无创的方式对内膜容受性分子如血管内皮生长因子受体(VEGFR2)等进行定位和定量，既有影像的检测又有功能的检测，为以后药物靶向治疗提供了可能性[15]。

三、基因表达检测

随着全基因组分析技术日趋成熟，子宫内膜基因谱的研究吸引了更多关注，包括对正常女性的内膜基因表达谱分析、反复种植失败或复发性流产患者的内膜基因表达谱分析、正常女性与不孕女性内膜基因表达谱比较、自然周期与卵巢刺激周期内膜基因表达谱比较。

Díaz-Gimeno等[16]构建了一种子宫内膜容受性芯片(endometrial receptivity array，ERA)，通过对种植期和种植前期的子宫内膜基因表达进行t检验，找出238种表达程度变化大于3倍的基因(t<0.05)，使用生物信息学的预测程序评估子宫内膜容受性的转录印记，将内膜分为植入期，植入前期及植入后期，进而确定胚胎移植窗口期[16]。Hashimoto等[17]对50个反复种植失败的不孕患者利用ERA在LH+7 d对子宫内膜状态进行检测，发现12/50(24%)的患者子宫为非容受型，根据ERA进行个性化移植后容受型与非容受型的病人妊娠率分别为58.8%和50%，结果无显著差异。另一项对至少一次整倍体胚胎移植失败的群体检测实验发现，非种植窗的诊断率为22.5%[18]，这也映证Hashimoto团队的研究：至少一次移植失败群体中非容受型内膜的检出率在1/5以上，故在反复移植失败群体中ERA是具有检测价值的。但对于非反复种植失败群体，ERA对于非容受性子宫的检出率远远低于反复种植失败人群(15% vs.27.5%)，所以ERA并不推荐作为胚胎移植人群的常规检查[19]。

另一方面，ERA并非唯一基因检测手段，也有研究团队尝试利用其他方法分析基因判断内膜状态。Enciso等[20]构建出另一种基于RT-qPCR基因表达分析的子宫内膜容受性图谱(endometrial receptivity map，ER map)，通过比较LH+2与LH+7的内膜活检标本，涉及细胞分裂增殖、细胞外基质组织与信息交流、免疫反应、血管增殖等84个表达显著变化的基因被选择出来，利用其中40个基因构建的辨别函数模型在正常月经周期供体内膜上的预测准确率达到100%。但研究的临床应用价值仍需要更多非选择性实验和随机对照实验证实。

总体来说，基因检测手段最大的问题是研究结果缺乏一致性。上百个利用微芯片检测基因表达的研究中，只有很少几个基因在两个或以上的研究中被同时证实。另一方面，基因并不能代表参与胚胎种植等多过程的蛋白质表达情况，基因预测内膜容受性的价值还需要更多大样本临床研究来支撑。

四、非编码RNA

在实际生物体中，胚胎植入过程相当复杂，大量信号转录通路涉及其中，找到合适的分子生物学标志物尤为关键。微小RNA(miRNA)在真核生物细胞中广泛存在，主要参与基因转录后的调控，多数具有高度序列保守性，表达时序性与组织特异性，且易于检测，这使得其成为热门的分子标志。

研究者通过比较正常生育妇女内膜植入前期与植入期、增殖晚期与分泌中期miRNA的表达变化，发现多种miRNA与子宫内膜状态相关[21]。miRNA的主要问题是可选择的研究靶点很多但特异性太差，这与机体状态的波动相关，导致各研究得出的结论缺乏一致性，没有一个准确的miRNA种类有足够的证据证明其意义。研究发现，利用逻辑回归方程将血清miR-27a-3p与miR-124-3p表达浓度联合构建受试者工作曲线，敏感性与特异性分别达到91.6%和80%[22]。这项研究的样本量小(n=12)，但提示利用多个miRNA构建模型也许可以大大提高检测有效性。

之前研究大多聚焦于子宫内膜活检组织中微小RNA的检测。最近一项对正常妇女及慢性子宫内膜炎患者的临床研究发现，血清中的微小RNA水平也与子宫内膜状态有着密切联系[22]。今年一项双队列研究分别比较分泌早期与分泌中期、正常受孕妇女与单独种植失败患者的血清miRNA表达谱，发现血清样本未能提示分泌早期与中期的任何内膜miRNA有显著变化。然而，反复移植失败患者中血清miR-30a-5p明显上调[23]，这提示血清miRNA-30家族可能在种植失败机制中起到一定作用，其对内膜容受性判断的价值仍有待商榷。另外，近200个长链非编码RNA(lncRNA)也被发现在反复移植失败及移植后正常受孕患者中存在差异表达[24]，提示lncRNA参与调节子宫内膜容受性。另一项对于子宫内膜异位症患者的研究表明，HOXA11-AS1虽然在内异症发展中起作用，但与内异症相关的不孕不存在明显关联[25]。尽管这项研究只局限于内异症群体，lncRNA作用具体机制及对ER判断的临床应用价值仍需要进一步研究。

五、细胞因子和各类受体

慢性子宫内膜炎在大多数研究中被证实与不孕相关，子宫内膜容受性受损是其中一项机制，这使得其成为研究子宫内膜状态的最好病理模型。整合素、IL-11、LIF等多种细胞因子均被发现在慢性子宫内膜炎中表达下调，并且这些因子在其他导致不孕的疾病如输卵管积水中也被发现有相应的表达下降[26]。随后，更多的相关分子标志物被发现，包括谷酰胺还原酶、抑制性糖蛋白、HOXA10、肝素结合表皮细胞生长因子等。这些分子或是胞饮突表面的受体、分泌的细胞因子，与囊胚的粘附、侵入密切相关；或是调节胞饮突的表达、抑制内膜上皮细胞的凋亡[7]。Edgell等[27]对于不明原因不孕妇女与生育能力正常妇女分泌中期宫腔液体的比较分析显示，CSF3、IL8等5个因子在正常分泌中期队列中浓度都明显增高。集落刺激因子与LIF与妊娠结局的显著关联也同样在其他研究中被证实[28]。

单个的细胞因子难以对内膜状态进行准确预测，2016年研究发现可以预测IVF失败的模型能在子宫内膜炎病人中提高治疗有效性。Krylova等[26]将研究对象分为3组，分别是子宫内膜炎治疗后成功妊娠妇女、IVF治疗后未能成功受孕妇女以及由于男方因素不孕的对照组，比较3组间雌孕激素受体分布、各种炎症因子区域表达百分比和视觉密度。基于Wilks策略构建出预测IVF结果的判别方程：P=0.04 A+126.0 B+3.7 C-23.5，O=0.09 A+83.9 B+1.9 C-13.4(P和O分别代表IVF的阳性和阴性结果，A=孕激素内膜腺体上的表达，B=LIF内膜腺体上的视觉密度，C=内膜基质TGFb1区域表达百分比)，这篇文章中建议对于将行IVF治疗的子宫内膜炎患者需同时行内膜活检组织学检查，在无充分证据(增生或炎症状态)阻碍内膜种植的情况下需进行复合免疫组化检查。尽管这一算法尚未被大型临床试验证实，但为将诸多内膜预测指标联系起来的方式提供一个方向。

六、子宫抽吸液中的蛋白组学与脂类分析

子宫内膜分泌物是由诸多离子、蛋白、类固醇、氨基酸和碳水化合物组成的复合物，其对种植成功的必要性早已在子宫腺体敲除的母羊和大鼠上都得到证实，腺体敲除的实验组在移入健康囊胚后都不能正常种植和内膜蜕膜化[29]。

内膜分泌物中各种蛋白对妊娠预后的评估是目前研究的焦点。最近两项研究都分别对妊娠成功与失败的IVF患者进行了子宫内膜蛋白病例对照分析。结果发现组间显著差异的蛋白基本上与细胞生长与黏附、能量通路、蛋白代谢与免疫反应相关，两组实验结果唯一的重叠蛋白是热休克蛋白[30-31]。将氧分压与不孕关联起来的各种酶同样可以作为判断指标，抗氧化标志物如超氧化物歧化酶SOD，过氧化氢酶CAT越高则妊娠结局越好；而氧分压标志脂质过氧化酶则与结局呈负相关[32]。

蛋白被认为是预测内膜容受性的可靠指标，但蛋白组学分析的低敏感性限制了其发展，且大多子宫分泌的蛋白都在血清中有表达，如若标本被血污染也会对结果造成较大干扰。因此提高子宫内膜分泌物取样和分析的技术是目前的突破口。近年来脂质分析开始时兴，许多脂类都对于人类生殖有着重要作用，且在胚胎植入阶段具有特异性的表达，如溶血性磷脂酸通过与其受体LPA3结合调节胚胎种植与前列腺素的水平，而前列腺素也被发现在囊胚种植区高度聚集且在反复种植失败的病人子宫中含量低下，应用COX2抑制剂可以完全阻断妊娠发生[33]。虽然子宫内膜抽吸液中的脂质对胚胎定植意义重大，对于其定量检测并根据检测结果判断内膜容受性的方法仍未被报道，脂质分析走向临床还需要一定时间。

子宫抽吸检查的准确性正逐渐被认可，甚至可以用于子宫内膜病理检查[34-35]。抽吸物内容不仅可以做分子分析，还能进行细胞学分析综合判断子宫内膜状态。但是由于抽吸样本量太少(1 ml)，检测的一致性较差，不同实验中抽吸液的组分都有着较大差异。尽管许多因子都被发现与内膜状态相关，目前尚缺乏预测灵敏度与特异度都高的综合模型。另外，技术方法仍受到很多限制，如内膜分泌物易受到抽吸过程中上皮细胞内容物的干扰、部分生物标志物由于抗体或交叉反应的原因无法检测，所以提高检测手段以及怎样将诸多标志物结合形成完整体系将是未来的研究方向。

胚胎移植后的成功种植与妊娠涉及胚胎质量、子宫内膜状态、内膜与胚胎同步性等诸多相关因素，更有大量的细胞分子和信号通路关联其中。通过准确判断子宫内膜状态，确定种植窗口期并进行个体化移植是提高辅助生殖技术成功率的一项简便可行的方案。目前判断子宫内膜的方法很多，既有宏观上的超声学检查，也包括基因、RNA、细胞因子等微观层面的检测，但是没有一项指标能够作为单一的判断标准。因此提高分子检测技术、寻找更可靠的预测标志、进行大型临床试验确定不同指标的种植区间以及如何将各种检测结果结合形成综合体系将是今后努力的方向。标准ER判断方案的诞生不仅能够通过为病人制定个性化促排与移植方案提高临床效率与结果，还能作为一项实验技术用于不同卵巢刺激方案效果的比较等。