囊胚整体质量对冻融单囊胚移植妊娠和新生儿结局的影响

蒋益群，李东，王珊珊，陈林君，史建彬，张宁媛

(南京大学医学院附属鼓楼医院生殖医学中心，南京 210008)

辅助生殖技术的应用提高了多胎妊娠率以及相关的孕产妇和新生儿并发症发生率，包括高血压、糖尿病、出血、贫血、绒毛膜羊膜炎、泌尿生殖系统感染、早产和低出生体重[1-2]。选择性单胚胎移植可使多胎妊娠率最小化，而囊胚越过了胚胎基因组激活阶段，可淘汰部分非整倍体胚胎，有助于胚胎挑选[3-4]。基于此,单囊胚移植技术已被大多数生殖中心广泛应用，通过选择最具活力的胚胎来提高妊娠率，降低多胎率。

关于囊胚形态参数与妊娠结局的相关性，结论不一。有的研究认为滋养层等级最能预测新鲜或冻融周期的单囊胚移植的妊娠成功[5-6]，而另一些研究则认为内细胞团等级是成功胚胎植入和活产的有力预测因子[7-8]，还有的研究建议评估囊胚腔的扩张程度以预测妊娠结局[9-10]。本研究考虑到囊胚滋养层(TE)和内细胞团(ICM)的高度动态性、内细胞团准确观察的困难性以及它们之间存在相互影响、相互促进的关系，我们设计了这项回顾性队列研究，评估在单囊胚冻融周期中囊胚整体质量与妊娠结局以及新生儿结局之间的相关性。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2016～2017年在本中心进行单囊胚冻融移植患者的临床资料。

纳入/排除标准：新鲜周期促排方案为常规长方案患者；女方年龄≤38周岁；移植日子宫内膜厚度≥8 mm；体重指数(BMI)18～25 kg/m2；排除供精、供卵及PGD/PGS周期病例。

共纳入984例患者。根据囊胚整体质量分为3组：A组为高质量囊胚(n=259)，B组为中等质量囊胚(n=400)，C组为低质量囊胚(n=325)。同时根据滋养层外是否存在碎片或卵裂球对C组患者进一步分组：C1组为不存在碎片或卵裂球(n=197)，C2组为存在碎片或卵裂球(n=128)。

二、囊胚培养与评分

常规促排卵及常规体外受精[11-12]后第3天，将移植冷冻后剩余胚胎转至囊胚培养液 G2(Vitrolife，瑞典)进行囊胚培养。第5、6天(D5、D6)观察胚胎，按照Gardner评分体系[13]对囊胚进行评分。本中心的冷冻标准为3BC和3CB及以上级别的囊胚。

本研究将高质量囊胚定义为：(3～6)AA、AB、BA；中等质量囊胚定义为：(3～6)BB、AC、CA；低质量囊胚定义为(3～6)CB、BC。

三、囊胚冷冻与复苏

对囊胚进行激光皱缩，然后将囊胚放入平衡液(ES)中平衡10～15 min，转入玻璃化冷冻液(VS)(KITAZATO，日本)中平衡30～60 s，转移至冷冻载杆(Cryotop)上，然后浸入液氮。在移植当天进行囊胚复苏，分四步，将待复苏囊胚依次置于复苏液(TS、DS、WS、WS)(KITAZATO，日本)中，将复苏囊胚移入提前准备好的囊胚培养液G2(Vitrolife，瑞典)中，放入37℃、6%CO2和5%O2的培养箱内培养2 h。移植前评估胚胎的存活情况，囊胚腔重新扩张判断为囊胚存活。

四、子宫内膜准备与囊胚移植

采用人工周期或自然周期进行子宫内膜准备。自然周期：月经规律，排卵正常者于月经周期的第12天开始阴道B超监测排卵，排卵日后第1天常规黄体支持，第5天胚胎移植；人工周期：排卵障碍者于月经第2天开始服戊酸雌二醇片(补佳乐,先灵，德国)，2～3 mg，Bid，服用10 d后开始阴道B超监测子宫内膜，当内膜厚度达到8 mm以上时开始常规黄体支持，黄体支持第6天胚胎移植。

五、妊娠判定标准

移植后14 d检测HCG指标，阳性者于移植后28 d行B超检查，见孕囊者确诊为临床妊娠。不足28周终止妊娠者为流产。

六、统计学方法

结 果

一、三组患者一般资料

A、B、C三组患者的女方年龄、不孕年限、不孕类型、BMI、FET内膜准备方案、移植当日内膜厚度均无显著性差异(P>0.05)，而三组患者间囊胚冷冻时期比较有显著性差异(P<0.05)(表1)。

组 别例数女方年龄不孕年限不孕类型原发不孕继发不孕BMI(kg/m2)A组25930.97±3.963.47±2.50115(44.40)144(55.60)21.07±2.08B组40030.96±3.943.75±2.69200(50.00)200(50.00)21.00±2.22C组32531.11±3.953.43±2.50164(50.46)161(49.54)20.94±2.44组 别例数FET内膜准备方案囊胚冷冻时期人工周期自然周期D5D6移植日内膜厚度(mm)A组259204(78.76)55(21.24)222(85.71)∗37(14.29)∗9.40±1.57B组400302(75.50)98(24.50)292(73.00)∗108(27.00)∗9.42±1.43C组325252(77.54)73(22.46)198(60.92)∗127(39.08)∗9.40±1.66

注：组间相互比较，*P<0.05

二、三组患者临床结局和新生儿结局

A、B、C三组患者间临床妊娠率(70.66% vs.60.75% vs.44.31%，P<0.05)及活产率(61.39% vs.48.00% vs.34.46%，P<0.05)均有显著差异；A、B、C三组患者的流产率逐渐增加，但无显著性差异(13.11% vs.19.75% vs.22.92%，P>0.05)；三组患者间新生儿出生体重无显著差异(P>0.05)(表2)。

三、C组患者两个亚组比较

1.一般资料：C1、C2两组患者间女方年龄、不孕年限、不孕类型、BMI、FET内膜准备方案、移植当日内膜厚度以及囊胚冷冻时期均无显著性差异(P>0.05)(表3)。

组 别例数临床妊娠率流产率活产率孕周新生儿体重(g)A组259183/259(70.66)∗24/183(13.11)159/259(61.39)∗38.21±1.653 426.73±578.80B组400243/400(60.75)∗48/243(19.75)192/400(48.00)∗38.02±1.643 361.80±481.65C组325144/325(44.31)∗33/144(22.92)112/325(34.46)∗38.45±1.633 395.98±456.61

注：组间相互比较，*P<0.05

2.临床结局及新生儿结局比较：与C1组比较，C2组的临床妊娠率(50.00% vs.40.61%，P<0.05)及活产率(39.84% vs.30.96%，P<0.05)均显著升高(表4)。

注：与C1组比较，*P<0.05

讨 论

在冻融单囊胚移植周期中，影响囊胚成功种植的因素有子宫内膜、囊胚质量以及患者心理因素等，其中囊胚质量是胚胎实验室关注的最重要的指标。我们的临床资料中显示，高质量囊胚组D5比例显著高于低质量囊胚组。武龙梅等[14]的研究也得出相似结果，他们回顾性分析冻融囊胚移植患者的临床资料，D5组与D6组相比，新鲜周期的囊胚形成率、优质囊胚率均显著增高。分析可能的原因：D6囊胚发育延迟，影响囊胚质量；优质囊胚在D5已被优先冷冻。

本研究结果显示：随着囊胚质量的增加，临床妊娠率和活产率均显著增加，流产率有降低趋势，但无显著性差异。Oron等[15]回顾性分析了冻融单囊胚移植周期1541例患者的临床结局，结果显示移植高质量囊胚相比低质量囊胚可获得更高的临床妊娠率和活产率。柳亚楠等[16]的研究将231例高质量囊胚与154例低质量囊胚进行比较，结果显示临床妊娠率(71.00% vs.42.86%)和活产率(54.55% vs.32.47%)均有显著性差异，囊胚的质量能显著影响妊娠结局。在一项通过形态学预测整倍体囊胚妊娠结局的研究中，作者强调整倍体囊胚总体质量、TE和ICM等级与患者妊娠结局正相关[17]。Irani等[18]的研究根据囊胚质量将701例囊胚分为好、中、差三组，其活产率和种植率有显著性差异。Minasi等[19]还研究了1 730个囊胚的倍性状态与形态学和形态动力学参数之间的潜在相关性，发现整倍体胚胎开始分裂、扩张和孵化的时间较短，而且高质量TE和ICM的比例较高，发育级别较高。

关于新生儿出生结局，我们的研究结果显示：孕周和新生儿出生体重与移植的囊胚质量无显著关联。孟庆霞等[20]的研究也表明内细胞团和滋养层质量并不能预测新生儿出生体重。王雪等[21]的研究显示，在单胎组中，D5和D6囊胚冻融移植后出生的新生儿孕周、出生体重和体长均无显著性差异，同时在双胎组中也得出相似的结果。也有研究指出，出生体重与内细胞团质量相关，因为内细胞团最终会发育成胎儿[22]。然而，出生体重的影响因素很多，包括新生儿性别、父母体重、孕妇的健康状况以及孕期营养等。本研究中新生儿结局的样本量相对较少，后续还需进一步排除混杂因素，做更深入研究。另有研究表明囊胚期胚胎相比于分裂期胚胎性别比有显著性差异[23-24]，可能由于男女胚胎染色体的差异，男性胚胎较女性胚胎具有更好的发育潜能[25-26]。因此，探讨囊胚质量与新生儿性别的关系，也需进一步扩大样本研究。

在临床工作中，我们发现形成的低质量囊胚，在滋养层外经常会出现排出的碎片或卵裂球，胚胎碎片有可能是促排卵或体外操作导致卵裂球损伤产生的，也有可能是胚胎修复机制，排出了染色体异常的卵裂球，或以碎片形式排出部分异常细胞[27-28]。我们的结果也显示，对于存在碎片或卵裂球的囊胚，其临床妊娠率及活产率不但没有受到影响，反而有显著性增加。有理由推断，本研究中低质量组的C2亚组囊胚由于排出了染色体异常的细胞，相比于C1亚组可能有更高的整倍性。因此，我们推断当内细胞团及滋养层质量达到一定等级时，滋养层外碎片及卵裂球不应作为一项负性指标。需要在以后的研究中对这一类型囊胚进行胚胎植入前遗传学检测(PGT-A)，进一步验证这一推断。

综上所述，本研究表明，在冻融单囊胚移植周期中，囊胚总体质量可预测患者临床妊娠率、活产率；同时，对于低质量囊胚，滋养层外碎片或卵裂球不应作为临床妊娠率和活产率的负性指标。本研究没有细分D5与D6囊胚，也没有对TE和ICM形态进行区分比较，而且这是一项回顾性研究，因此，在以后的研究中需要有更大的队列进行前瞻性研究来综合考量目前的结论。