芪明颗粒防治早期放射性视网膜病变的机制研究

刘爱琴 ，王倩 ，阮琳洁 ，董国军 ，严然

放射性治疗是肿瘤常见治疗方式之一，尤其是头颈部肿瘤，约有65%～75%的恶性肿瘤患者治疗方案中包含放射性治疗[1]。持续的低剂量或超过阈值的剂量会损伤眼部的葡萄膜血管、视网膜，形成放射性视网膜病变（Radioactive Retinopathy，RR），即慢性进行性、迟发性视网膜、脉络膜和视盘的血管闭塞性疾病[2]，临床表现以患者的视功能下降为主，对肿瘤患者的生活质量造成严重影响，是放疗后常见致盲的原因之一。目前对视网膜病变的干预，西医治疗主要以玻璃体腔注药[3]、视网膜激光光凝[4]、光动力疗法[5]、皮质类固醇[6]、抗血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）[7]治疗等，多适用于中后期症状表现明显的患者。中医认为此病属于“视瞻昏渺”“暴盲”等范畴，治疗以益气化瘀通络、补益肝肾为原则，达通络明目之效[8]。邓永红等[9]研究证实芪明颗粒能够早期及时干预放射性视网膜损伤，导致视网膜的血管微循环好转，促进视网膜出血、渗出的重吸收，从而明显的改善视功能。研究发现内质网应激反应与RR的新生血管生成存在一定的关系，并调控低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1,HIF-1α)进一步作用VEGF的表达。因此，本实验通过观察芪明颗粒对早期RR大鼠模型用药过程中病变视网膜组织形态学改变，检测内质网应激反应相关蛋白 (C/EBP-homologous protein，CHOP)的表达，以及HIF-1α、VEGF表达情况，从而明确芪明颗粒干预RR的疗效，并对其机制进行研究，为临床治疗放射性视网膜病变提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

2月龄清洁级Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠75只，平均体重约200 g。饲养环境：空气流通，室温18～26℃，相对湿度 55%～70%，12 h昼夜交替，适应性饲养7 d后，随机分为正常组、模型组、中药组，共3组，各25只。

1.2 仪器与试剂

用于放射造模的 Elekta Com Pact(TM)治疗器(瑞典医科达公司生产)；眼科手术显微镜（苏州六六公司）；视网膜组织切片观察分析用显微镜（Olympus,Tokyo,Japan,BX53）。正常组与模型组选用0.9%氯化钠注射液；中药组选用芪明颗粒（成都中医药大学附属医院药剂科生产，批号：980908）。

1.3 模型制作

将大鼠按体重决定麻醉剂量，照射前模型组和中药组均按照7%的水合氯醛5 ml/kg麻醉。麻醉方法：用左手固定住大鼠颈部，小拇指紧扣尾部，对腹部进行常规消毒，右手于右下腹部进针，向上约45°，刺入腹腔为止，等大鼠无翻正反射后，使其俯卧在放射台上，用透明胶布固定，暴露头上部。将放射区域调整在2 cm×2 cm范围，将光野上界调在双眼内眦的连线上，下界调在双耳后的连线上，进行放射对位，利用铅块将放射野外的躯干部位进行遮蔽，使得口腔和鼻腔排外放射。将放射调整为SSD模式，距离100 cm，深度及等效为2 cm，吸收率80 cGy/min，照射量10 Gy/次，每次持续照射约13 min，1周进行1次照射，共3次，总剂量为30 Gy。待照射完毕后，大鼠苏醒便立即送回到眼科实验室，照射组分组后常规饲养。

1.4 用药方法

各组大鼠在造模后3个月开始给药，连续灌胃1个月。具体给药步骤及方法如下。

正常组：灌胃剂量与中药剂量组大鼠等容量的生理盐水，每日1次。

模型组：灌胃剂量与中药剂量组大鼠等容量的生理盐水，每日1次。

中药组：将芪明颗粒加入生理盐水搅拌均匀，配成芪明颗粒水溶液。根据标准成人（以60 kg体重计算）的口服剂量，芪明颗粒（4.5 g，每日3次）服用剂量13.5 g/日，合算为0.225 g/kg的日用量。

1.5 观察指标

1.5.1 大鼠视网膜组织形态观察 分别于用药1个月、3个月后取其右眼行HE染色，制备视网膜消化铺片，在不同的倍数下观察视网膜血管走行、分布，以及周细胞、内皮细胞形态特点。

1.5.2 大鼠视网膜CHOP、HIF-1α、VEGF表达检测分别于用药1个月、3个月后取各组大鼠左眼进行免疫组化染色，统计CHOP、HIF-1α、VEGF的表达情况。具体免疫组化染色方法：（1）取石蜡切片于烤片机烘烤 2～3 h，放置 60℃烤箱 18 h；（2）用吹风机吹至产生蜡液，采用二甲苯脱蜡20 min，并在无水酒精与蒸馏水配置的梯度乙醇中脱水；（3）将配置好的枸橼酸缓冲液于高压锅中煮沸后，将切片置入，高压煮沸加热2～3 min，取出切片自然冷却至室温；（4）切片放置3%过氧化氢罐中10 min，取出用自来水冲洗多次，最后一次用PBS冲洗；（5）50 ul山羊血清封闭 10 min，滴加一抗（1：40），放置 4℃冰箱14 h；（6）PBS 冲洗 3 次，每次约 3～5 min；擦拭组织周围水分，加入Envision二抗，放置37℃孵箱中25 min；（7）PBS 冲洗 3 次，每次约 3～5 min；滴加 DAB显色剂，显色后反复自来水清洗；（8）切片置入苏木精罐复染5 min，反复自来水清洗；（9）置入1%盐酸酒精数秒后，用凉清水冲洗；置入氨水罐数秒后，用自来水冲洗；（10）取梯度乙醇对切片脱水，利用二甲苯透明，用树脂封好组织切片。

图1 各组早期RR视网膜细胞组织形态（HE ×200）。 1A 用药1个月后正常组；1B 用药1个月后模型组；1C 用药 1个月后中药组；1D 用药3个月后正常组；1E 用药3个月后模型组；1F 用药 3个月后中药组

1.6 统计学方法

采用SPSS19.0软件进行分析，对比分析视网膜各层细胞、组织变化。多组数据采用单因素方差分析方法，两两比较采用最小显著差异法（LSD）。数据结果用平均值±标准差（x¯±s）表示，以 P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 芪明颗粒作用于早期RR视网膜细胞组织形态

用药1个月后，模型组视网膜显著变薄，主要为外核层、内核层，节细胞层细胞组织排列紊乱水肿，无色素层细胞，余各层细胞排列稀疏。与模型组相比较，中药组节细胞层细胞组织更整齐致密，外核层、内核层层数及形态比较完整，水肿减轻，无明显水肿及空泡（图 1A-1C）。

用药3个月后，模型组视网膜内界膜、视神经纤维层的毛细血管增生，扩张，纤维不同程度增生。与模型组比，中药组节细胞层细胞组织显著整齐，外核层、内核层形态比较完整（图1D-1F）。

2.2 芪明颗粒影响早期RR视网膜CHOP蛋白、HIF-1α蛋白和VEGF表达的影响

CHOP蛋白表达：用药1个月、3个月后，与正常组相比，模型组、中药组表达均增多。与模型组比较，中药组表达均减少，1个月后两组含量比较（t=2.563，P=0.028），3 个月后 2 组含量比较 （t=9.513，P=0.000）均具有统计学意义。（表1、图2A-2F）

HIF-1α蛋白表达：用药1、3个月后，与正常组相比，模型组、中药组表达均增多。与模型组比较，中药组表达均减少，1个月后2组含量比较 （t=7.873，P=0.000），3 个月后 2 组含量比较（t=7.412，P=0.000）均具有统计学意义。（表1、图3A-3F）

VEGF蛋白表达：用药1、3个月后，与正常组相比，模型组、中药组表达均增多。与模型组比较，中药组表达均减少，1个月后两组含量比较 （t=4.072，P=0.002），3 个月后两组含量比较 （t=11.986，P=0.000）均具有统计学意义。（表1、图4A-4F）

表1 各组早期RR视网膜CHOP蛋白、HIF-1α蛋白和VEGF平均光密度值比较（x¯±s，n=6）

图2 各组视网膜CHOP免疫组化染色（×200）。 2A用药1个月后正常组；2B用药1个月后模型组；2C用药1个月后中药组，中药组CHOP阳性表达低于模型组；2D 用药3个月后正常组；2E 用药3个月后模型组；2F 用药3个月后中药组，中药组CHOP阳性表达低于模型组，与正常组相近。CHOP蛋白存在以节细胞胞浆为主的视网膜各层细胞胞浆中，阳性胞浆呈棕黄色、黄色。CHOP：内质网应激反应相关蛋白

图3 各组视网膜HIF-1α免疫组化染色（×200）。 3A用药1个月后正常组；3B用药1个月后模型组；3C用药1个月后中药组，中药组较模型组HIF-1α阳性表达低，与正常组相近；3D用药3个月后正常组；3E用药3个月后模型组；3F用药3个月后中药组，中药组较模型组HIF-1α阳性表达明显低，与正常组更近。HIF-1α蛋白存在以节细胞胞浆为主的视网膜各层细胞胞浆中，阳性胞浆呈棕黄色、黄色。 HIF-1α：低氧诱导因子-1α

图4 各组视网膜VEGF免疫组化染色（×200）。4A 用药1个月后正常组；4B 用药1个月后模型组；4C 用药1个月后中药组，中药组较模型组VEGF阳性表达低，与正常组相近；4D 用药3个月后正常组；4E 用药3个月后模型组；4F 用药3个月后中药组，中药组较模型组VEGF阳性表达明显低，与正常组更近。VEGF蛋白存在以节细胞胞浆为主的视网膜各层细胞胞浆中，阳性胞浆呈棕黄色、黄色。VEGF：血管内皮生长因子

3 讨论

超阈值剂量或持续低剂量的放射线照射对眼部造成的视力影响，主要由于眼底毛细血管的周细胞的损伤、内皮细胞的受损、丧失，毛细血管管壁变性增厚导致血管狭窄阻塞，微循环障碍，从而引发视网膜缺血、缺氧，激发内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)，诱导氧化反应，调控下游CHOP蛋白高表达，进而诱导细胞凋亡[10]。VEGF是缺血、缺氧的条件下视网膜新生血管生成的关键因子，可迅速提高微血管的通透性，促进血浆蛋白大量分泌，导致血管渗漏；同时促进内皮细胞在有丝分裂过程中死亡，难以补偿丢失的细胞，诱发新的血管腔形成，造成血-视网膜屏障，继而血管内液体外漏，导致视网膜水肿或浅脱离，长期的水肿最终出现神经元变性坏死、视功能下降[11]。HIF-1α作为低氧诱导因子，在缺氧条件下可稳定VEGF的活性，加速新生血管的发生发展[12-13]。目前对于早期放射性视网膜病变的干预，西医治疗并无明确优势。

芪明颗粒因其具有多靶点直接促进癌细胞凋亡，抑制肿瘤血管增生等作用，在肿瘤辅助治疗领域具有巨大潜力[14]。现代研究证明黄芪可通过清除活性氧，进而保护视网膜细胞组织的作用；枸杞多糖的抗氧化作用可对视网膜神经节细胞起保护作用[15]，决明子可提高乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）的含量，以产生丰富的腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）为机体功能，扩张末梢血管，改善视神经的血液循环[16]，水蛭可降低HIF-1α介导的VEGF mRNA表达，抑制新生血管的生成，改善微环境缺血、缺氧状态，从而达到抗肿瘤的作用[17]。此外，中医认为放射线属火热毒邪，直中目系，灼伤目中阴血、津液，则目络失养，故RR早期病机特点可概括为火热伤津，气阴两虚，当以益气养阴通络为要，且目为肝窍，瞳神属肾，肝肾精血亏损则无以滋养目窍，故芪明颗粒益气生津，滋养肝肾，通络明目之功效符合早期RR的治法。本实验发现用药1个月、3个月后，视网膜组织细胞水肿显著减轻，细胞形态、排列均有所改善，随着用药时间延长，CHOP、HIF-1α、VEGF等表达逐渐下降向正常靠近。因此我们证实芪明颗粒可通过抑制CHOP蛋白的表达，干预内质网应激反应，缓解视网膜水肿，恢复视网膜细胞组织形态，同时调控HIF-1α降低VEGF，抑制了新生血管的生成及发展，最终改善早期放射性视网膜病变。而放射性视网膜病变的发病机制较为复杂，本实验只证明内质网应激反应引起新生血管生成可能是其发病机制之一，因此芪明颗粒干预早期放射性视网膜病变机制还有待进一步研究。