肝失疏泄大鼠模型眼压和眼压波动

武燕，马秋艳，杨迎新，张丹丹，何宇鹏，杨玥

随着整合眼科学的快速发展，越来越多的研究开始关注全身疾病对眼睛的影响。中医学将原发性开角型青光眼称为“青风内障”。在临床上，中医理论认为肝失疏泄导致的青光眼最为常见[1-3]。肝失疏泄的临床特征表现为气急、易怒、头痛、眼胀及视物模糊。另外，国际上主流的研究表明，眼局部高眼压[4-5]和大的眼压波动[6-7]均为青光眼进展的危险因素。因此，全身肝失疏泄是否会导致眼局部高眼压和大的眼压波动，从而导致青光眼的发生和发展，目前尚不清楚。本研究拟通过肝失疏泄大鼠模型，明确肝失疏泄大鼠模型的眼压和眼压波动情况。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康同系Sprague-Dawley雄性大鼠28只，体重200～220 g，SPF级，由北京维通利华实验动物技术公司提供。随机分为2组。正常组14只，群养观察；模型组（肝失疏泄组）14只，孤养，按程序施加造模刺激。光照节律 12/L:12/D （6:00～18:00），室温（22±2）℃，保持动物室安静，相对湿度 30%～40%，常规饲料及正常饮水，每周测定体重。造模4周后测24 h眼压，每周1次，共3次。测量时间为9:00～10:00,13:00～14:00,17:00～18:00,21:00～22:00,1:00～2:00。因动物死亡及标本制作等因素，最后有效数据第4周正常组24只眼，模型组12只眼，第5周正常组14只眼，模型组10只眼，第6周正常组12只眼，模型组6只眼。

1.2 动物模型的建立

结合参考文献［8］公认的肝郁证方法复制动物模型：夹尾 1 min，4℃冰水游泳 5 min，禁水 24 h，禁食24 h，昼夜颠倒24 h，45℃热环境5 min。上述刺激1种/d，每种刺激各3次，随机安排，使动物无法预知次日的刺激。大鼠肝郁模型造膜成功的判定标准：肝郁造模大鼠随着造模时间的增加，逐渐出现肝郁证的行为学特征即大鼠饮水量增加，容易激惹，咬人，喜欢扎堆、贴边，大便松散而特臭。

1.3 主要仪器与试剂

Tono-Pen AVIA手持式眼压计（美国Reichert公司），桌面式小动物麻醉机（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），异氟烷（国药准字H19980141，河北九派制药有限公司），盐酸奥布卡因滴眼液（日本参天株式会社），左氧氟沙星滴眼液（日本参天株式会社）。

1.4 眼压测量方法

SD大鼠用桌面式小动物麻醉机麻醉 （参数：氧浓度0.8%，异氟烷浓度5%），平放于桌面保温毯，侧卧位，采用Tono-Pen AVIA眼压计，测量双眼眼压3次取其平均值作为最后测量结果。

1.5 统计学方法

应用SPSS 15.0软件进行统计学处理，数据采用均数±标准差(x¯±s)表示，采用协方差分析，控制大鼠体重，比较2组在第4周、第5周和第6周三个阶段，组间的平均眼压和眼压波动（24 h眼压的峰值减去谷值）变化。采用独立样本t检验比较2组大鼠体重及基线眼压值；当P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组基线眼压值和各个时间点体重比较

适应性饲养3 d后，随机将SD大鼠分为正常组和模型组，在同一时间点测大鼠基线眼压，正常组为（15.79±1.71） mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）和模型组为（16.10±1.34） mm Hg，差异无统计学意义(t=-0.72,P=0.48)。 分别测得 2 组基线体重，正常组为（198±6）g，模型组为（195±7）g，差异无统计学意义（t=-0.63，P=0.72）。 第 4 周，正常组体重（362±28） g，模型组为（327±25） g，差异有统计学意义（t=3.58，P=0.00，见图1）。 在第 5 周，正常组体重为（432±44） g，模型组为（327±19） g，差异有统计学意（t=5.97，P=0.00）。 第6 周，正常组体重为（443±57）g，模型组为（382±15）g，差异有统计学意义（t=3.49，P=0.00，见图 1）。

图1 2组的体重变化

2.2 造模4周后2组平均眼压比较

造模4周后，模型组的24 h平均眼压为（16.55±0.91）mm Hg，而正常组为（16.06±0.99） mm Hg，差异无统计学意义（F=0.23，P=0.63）。造模第5周，模型组的 24 h 平均眼压为（12.82±0.61）mm Hg，正常组的（12.66±1.08） mm Hg，差异无统计学意义（F=0.56，P=0.78）；造模第6周，模型组平均眼压为 （14.64±1.13）mmHg，高于正常组（13.23±1.08）mmHg，差异有统计学意义（F=3.53，P=0.04，见图 2）。

图2 2组的平均眼压变化

2.3 造模4周后2组24 h眼压波动比较

眼压波动值为24 h眼压的峰值减去谷值。造模4周后，模型组的24 h眼压波动在第4周、第5周和第 6 周分别为 （3.49±0.73）mmHg、（4.54±2.28）mmHg和 （5.44±1.59）mm Hg,分别高于正常组的 （3.47±1.06）mmHg、（4.31±1.22）mmHg 和 （4.03±2.04）mmHg，差异无统计学意义（P＞0.05，见图 3）。

图3 2组的眼压波动

3 讨论

元代朱丹溪《格致余论》[9]云：“司疏泄者肝也”。中医眼科整体观点认为，五脏中以肝和眼的生理病理关系最为密切。肝开窍于目，足厥阴肝经连目系。肝主气，喜条达而恶抑郁，暴怒伤肝。肝藏血，目受血而能视。外界突然的或持久的精神刺激可造成肝气郁滞、玄府闭塞、目系失养而视朦目盲，或导致暴怒伤肝、气血受损而急速暴盲；或抑郁寡欢、气机疏泄不利、气血失养日久、目系萎陷而逐渐青盲。以往研究[8]通过对大鼠施加慢性刺激，成功造出大鼠肝郁证模型，肝郁证大鼠发生了多种生理机能的变化，而中医学五脏中，肝与眼的关系最为密切，所以，肝的疏泄功能失调，会在眼有所体现。研究表明[10]，平均眼压升高1 mm Hg，青光眼进展速度加快11%。本研究，我们对比了肝失疏泄大鼠模型与正常大鼠的眼压变化，造模后第4周和第5周模型组的24 h平均眼压均高于正常组。在造模后第6周，模型组平均眼压为显著高于正常组，差异有统计学意义。

本研究发现肝失疏泄大鼠呈现出大的昼夜眼压趋势，造模后，模型组的24 h眼压波动在4周、5周和6周均高于正常组的各时间段。Asrani等[11]和Advanced Glaucoma InterventionStudy(AGIS)[12]证实无论是长期眼压波动还是24 h日间眼压波动均是青光眼进展的独立危险因素。AGIS研究证实，长期眼压波动大于1mm Hg，青光眼进展速度加快31%[12-13]。

肝主疏泄功能正常即可使眼的机能处于一个稳定状态，表现为眼部血流及眼压稳定。否则，肝失疏泄，眼部血流和眼压波动[14-15]，而损害神经节细胞。越来越多研究证实，眼压波动[16-17]与肝失疏泄病机密切相关。研究发现[17-22]，保持稳态为肝主疏泄核心，动机和情绪中枢大脑边缘系统为肝主疏泄调控中枢；下丘脑—垂体—肾上腺轴是其信息通路；平滑肌系统是肝主疏泄功能得以实现的效应器。严灿等[22]也认为肝失疏泄的中枢神经生物学机制与调节下丘脑—垂体—肾上腺轴有关。而眼压波动正是由下丘脑—垂体—肾上腺轴调控，与皮质类固醇有关，血浆皮质类固醇水平与眼压呈正相关[23]，眼压峰值出现于血浆皮质类固醇达到峰值水平后3～4 h，干扰皮质类固醇周期可改变眼压的波动曲线，口服皮质类固醇合成抑制药可降低眼压水平。

大鼠具有同人类一样的昼夜眼压波动现象。马建洲等[24]报道大鼠的眼压同正常人群眼压分布规律一样，均呈高斯分布，24 h眼压波动范围为 （3.12±1.19）mm Hg。上午眼压较低，然后逐渐升高，晚间眼压明显高于白天眼压，随后回落至基础眼压，如此循环。Carla JAbbott等[25]对清醒状态的挪威大鼠进行配合训练后，用TonoLab眼压计测量，基线水平也在20 mm Hg左右。以往对于大鼠基线眼压的测量，因受到测量仪器和是否麻醉的影响，报道结果不一致。Moore[26]报道大鼠平均眼压为（15.20±1.23）mm Hg。本研究采用Tono-Pen AVIA手持式眼压计，对42只SD大鼠用桌面式小动物麻醉机麻醉后，基线眼压为（15.94±1.56） mm Hg，与上述眼压值接近。

结合对实验动物的具体应用，本研究对实验大鼠的眼压测量总结为：样本量小时，对大鼠进行充分的行为训练测得的眼压数值最可靠；而当样本量较大时，应用异氟醚或七氟醚吸入麻醉更为实际，且考虑其对其他系统影响小，苏醒快的特点，眼压数值亦较为可靠。