钝顶螺旋藻对“中科3号”异育银鲫生长、抗氧化及非特异性免疫指标的影响

孙学亮 杨树元 毕相东 刘 波 陈成勋 郭永军*

（1.天津农学院水产学院 天津市水产生态及养殖重点实验室，天津300384；

2.天津市西青区杨柳青镇农业服务中心，天津300380）

“中科3号”异育银鲫，为中国科学院水生生物研究所筛选培育的异育银鲫第三代新品种，其特点是生长快，水温适应范围广，对水体pH值、盐度、低溶解氧等理化因子有较强的耐受力[1]，是一种肉质鲜美、鱼肉品质和营养价值较高，营养成分易被人体吸收的低脂肪和高蛋白的优质鱼类。

螺旋藻广泛分布于世界各地的海水、咸淡水和淡水中[2]，繁殖速度快且条件简单，可进行大量的人工繁殖，其市场经济价值很高。目前国内外大规模人工培育的螺旋藻主要有钝顶螺旋藻、极大螺旋藻和印度螺旋藻[3]，其中，钝顶螺旋藻被广泛应用于鱼、虾、蟹、贝等水产动物的饵料或作为饲料添加剂[4-5]。它具有高蛋白质、高营养，增强和调节机体免疫力等特性，并且含有较多的维生素和微量元素[6-7]。由于螺旋藻藻体微小，加之细胞壁结构主要是蛋白质，纤维素含量少，极易被水生动物消化吸收，消化率达75%[8]，可直接作为动物和鱼类的开口和幼苗饵料[9]。

本试验通过在饲料中添加钝顶螺旋藻，研究其对异育银鲫生长、抗氧化、非特异性免疫指标的影响，以期为钝顶螺旋藻在水产养殖中的应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验鱼购自天津市恒兴富民水产养殖专业合作社，初始体重为(102.08±0.38) g。

钝顶螺旋藻粉购自天津市晨辉饲料有限公司。异育银鲫基础饲料购自山东市海博农牧科技有限公司。

1.2 试验方法

试验开始前使用基础饲料驯化7 d。在基础饲料中添加0%、0.8%、1.6%、3.2%的钝顶螺旋藻。试验为期60 d。每个水平设两个重复，每箱32尾，试验开始前对试验鱼进行体重的测量。连续喂食60 d后取样，测定生长指标、血浆生理指标、非特异性免疫指标等。基础饲料营养成分为粗蛋白质≥28%、粗纤维≤10%、粗脂肪≥3%、粗灰分≤15%、水分≤14%。

1.3 试验管理

试验地点为天津农学院水循环养殖实验室，在水族箱中进行喂养。每天分三次投喂，时间分别为8：00、13：00和18：00，投喂量占鱼体重量的1%左右。投喂半小时后清理残饵和粪便，每天换水一次，换水量20%。

1.4 样品采集

喂食60 d后，将试验鱼饥饿24 h后称重取样，每箱随机取9 尾鱼，测量体长、体重等。使用注射器尾静脉取血，装入2 ml的离心管，加入少量肝素钠，然后3 000 r/min（冷冻离心机）离心10 min，取上清液装入另外的试管中，-80 ℃冷冻保存，用于血浆指标测定。取肝胰脏，-80 ℃保存备用。

1.5 测定指标

1.5.1 生长指标

存活率（SR，%）=100×Nt/N0

增重率（WGR，%）=(Wt-W0)×100/W0

蛋白质效率（PER，%）=(Wt-W0)×100/(F×P)

特定生长率(SGR，%/d)=[ln(Wt)-ln(W0)]×100/t

饲料系数（FCR）=F/(Wt-W0)

肝体比（HSI，%）=100×Wg/Wt

肥满度(CF，g/cm3)=Wt/lt3

式中：t——试验天数（d）；

Nt——终末存活尾数；

N0——初始放养尾数；

W0——平均初始体重（g）；

Wt——平均最终体重（g）；

F——饲料摄取量干重（g）；

P——饲料蛋白质含量（%）；

Wg——肝胰脏质量（g）；

Lt——平均终末鱼体长（cm）。

1.5.2 生理指标

使用全自动血细胞分析仪对实验鱼全血进行如红细胞、白细胞、中间细胞等的细胞数量和细胞比率的测定，以及血红蛋白含量和红细胞压积比率等的测定分析。

1.5.3 生化指标

蛋白酶活力的测定

制作蛋白酶活力标准曲线：将已配制好的不同浓度酶标准溶液加入试剂做显色处理，在680 nm波长下比色，测定光密度。以光密度读数为纵坐标（Y），酪氨酸克数为横坐标（X），绘制曲线。蛋白酶活力标准曲线方程：

Y=0.001 8X+0.002 2，R2=0.998 5

分别准备测定管和对照管，测定管添加不同组的5%肠道上清液，每组三个平行；对照管加入去离子水。按照实验操作依次加入配制好的试剂，37 ℃水浴，离心，显色。在680 nm 波长下比色，以对照管校零，读取测定管光密度进行记录。

总超氧化物歧化酶（T-SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、总抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、谷丙转氨酶（GPT）及谷草转氨酶（GOT）、脂肪酶（LPS）、淀粉酶（AMS）测试盒购自南京建成生物工程研究所。

1.6 数据处理

试验所得数据均采用“平均值±标准差”表示，用SPSS 19.0 软件对数据进行统计学分析，先将数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA，LSD)，差异显著(P＜0.05)的用Duncan's法做多重比较。

2 结果

2.1 添加不同比例的钝顶螺旋藻对异育银鲫的生长指标的影响（见表1）

表1 添加不同比例的钝顶螺旋藻对异育银鲫生长指标的影响

由表1 可知，最终体重、增重率、特定生长率、蛋白质效率随添加量的增加呈上升趋势，其中1.6%、3.2%组最终体重、增重率、特定生长率（SGR）显著高于0%、0.8%组，且1.6%、3.2%组之间无显著差异（P＞0.05)；在蛋白质效率（PER）方面，1.6%、3.2%组显著高于0%组（P＜0.05），0.8%组与0%组无显著差异（P＞0.05)；在饲料系数（FCR）方面，各试验组随添加量的增加呈下降趋势，但试验组间无显著差异（P＞0.05)；肥满度(CF)和肝体比（HSI)方面各试验组间无显著差异（P＞0.05)。

2.2 添加不同比例的钝顶螺旋藻对异育银鲫血浆生理指标的影响（见表2）

表2 添加不同比例的钝顶螺旋藻对异育银鲫的血浆生理指标的影响

由表2可见，添加不同比例的钝顶螺旋藻对异育银鲫血红蛋白、红细胞总数、白细胞总数、中性粒细胞总数、中间细胞总数、淋巴细胞总数、淋巴细胞比率、中间细胞比率、中性粒细胞比率、红细胞压积生理指标均无显著差异（P＞0.05)。

2.3 不同比例钝顶螺旋藻对异育银鲫血浆及肝胰脏抗氧化的影响

2.3.1 不同比例钝顶螺旋藻对异育银鲫血浆及肝胰脏总超氧化物歧化酶活力的影响（见表3）

表3 添加不同比例钝顶螺旋藻对异育银鲫血浆及肝胰脏总超氧化物歧化酶（T-SOD）活力的影响

由表3 可知，随着钝顶螺旋藻添加量的增大，血浆中T-SOD 酶活力呈逐渐上升的趋势，3.2%添加组达最大值，且显著高于0%、0.8%、1.6%添加组（P＜0.05）。肝胰脏T-SOD 酶活力0.8%、1.6%、3.2%添加组显著高于0%添加组（P＜0.05），且组间无显著差异（P＞0.05)。

2.3.2 不同比例钝顶螺旋藻对异育银鲫血浆及肝胰脏过氧化氢酶活力的影响（见表4）

如表4 可知，随着钝顶螺旋藻添加量的增大，血浆中CAT酶活力呈逐渐上升的趋势，3.2%添加组显著高于0%、0.8%、1.6%添加组（P＜0.05）。各试验组肝胰脏CAT 酶活力均显著高于0%添加组（P＜0.05），且组间无显著差异。

表4 添加不同比例钝顶螺旋藻对异育银鲫血浆及肝胰脏过氧化氢酶（CAT）活力的影响

2.3.3 不同比例钝顶螺旋藻对异育银鲫血浆及肝胰脏丙二醛(MDA)含量的影响（见表5）

表5 添加不同比例钝顶螺旋藻对异育银鲫血浆及肝胰脏丙二醛（MDA）含量的影响

如表5 可知，3.2%添加组血浆中MDA 含量显著低于其他组（P＜0.05）,其他添加组间差异不显著（P＞0.05）；肝胰脏丙二醛（MDA）含量各组间无显著差异（P＞0.05）。

2.3.4 不同比例钝顶螺旋藻对异育银鲫血浆及肝胰脏总抗氧化能力的影响（见表6）

如表6 可知，0.8%、1.6%、3.2%添加组血浆、肝胰脏总抗氧化能力与0%添加组无显著差异（P＞0.05）。

表6 添加不同比例钝顶螺旋藻对异育银鲫血浆及肝胰脏总抗氧化能力（T-AOC）的影响

2.3.5 不同比例钝顶螺旋藻对异育银鲫血浆及肝胰脏谷胱甘肽过氧化物酶活力的影响（见表7）

表7 添加不同比例钝顶螺旋藻对异育银鲫血浆及肝胰脏谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力的影响

如表7 可知，0.8%、1.6%、3.2%添加组血浆、肝胰脏GSH-Px活力与0%添加组无显著差异（P＞0.05）。

2.4 不同比例钝顶螺旋藻对异育银鲫非特异性免疫的影响

2.4.1 不同比例钝顶螺旋藻对异育银鲫血浆及肝胰脏碱性磷酸酶活力的影响（见表8）

表8 添加不同比例钝顶螺旋藻对异育银鲫血浆及肝胰脏碱性磷酸酶（AKP）活力的影响

如表8可知，0.8%、1.6%添加组血浆、肝胰脏AKP活力与0%添加组无显著差异（P＞0.05）；3.2%添加组显著高于0%添加组（P＜0.05）。

2.4.2 不同比例钝顶螺旋藻对异育银鲫血浆及肝胰脏酸性磷酸酶活力的影响（见表9）

表9 添加不同比例钝顶螺旋藻对异育银鲫血浆及肝胰脏酸性磷酸酶（ACP）活力的影响

如表9 可知，0.8%、1.6%、3.2%添加组血浆、肝胰脏ACP活力与0%添加组无显著差异（P＞0.05）。

2.5 不同比例钝顶螺旋藻对异育银鲫肝功能的影响（见表10）

表10 添加不同比例钝顶螺旋藻对异育银鲫血浆谷草转氨酶与谷丙转氨酶酶活力的影响(卡门氏单位)

如表10可知，1.6%、3.2%添加组血浆GOT活力显著低于0%添加组（P＜0.05）；0.8%添加组显著高于0%添加组（P＜0.05）。1.6%、3.2%添加组GPT活力显著低于0%添加组（P＜0.05）；0.8%添加组显著高于0%添加组（P＜0.05）。

2.6 添加不同比例的钝顶螺旋藻对异育银鲫肠道消化酶活力影响(见表11)

表11 添加不同比例的钝顶螺旋藻对异育银鲫肠道消化酶活力的影响(U/mg prot.)

由表11可知，蛋白酶活力随着添加量的增加，呈上升趋势，其中0%、0.8%组分别与1.6%、3.2%组产生显著差异（P＜0.05)，0%、0.8%组之间差异不显著（P＞0.05)，1.6%组显著低于3.2%组（P＜0.05)；淀粉酶活性0%、0.8%、1.6%、3.2%四组之间差异不显著（P＞0.05)；脂肪酶活性在0.8%组达到最高，0%、0.8%组比1.6%、3.2%组活性显著升高（P＜0.05)，0%、0.8%组之间和1.6%、3.2%组之间差异不显著（P＞0.05)。

3 讨论

3.1 添加不同比例的钝顶螺旋藻对异育银鲫生长、生理指标的影响

本试验通过对基础饲料中添加不同比例的钝顶螺旋藻对异育银鲫生长的影响发现，在基础饲料中添加3.2%比例的钝顶螺旋藻对异育银鲫的增重率（WGR）有了明显的提升，饲料系数也有明显降低，与0%组形成了显著差异（P＜0.05）；在血浆生理指标如红细胞、白细胞、中间细胞数量等没有产生显著差异（P＞0.05），血红蛋白、白细胞，红细胞比率没有产生显著差异（P＞0.05）；综上所述，在基础饲料中添加3.2%比例的钝顶螺旋藻对异育银鲫的生长有显著增长。本试验中四组试验鱼的红细胞、白细胞等数量和比率没有产生显著差异（P＞0.05），血红蛋白也没有显著差异（P＞0.05）。

国内目前对螺旋藻在饲料的添加应用进行了比较多的研究。吕子君[10]通过试验表明钝顶螺旋藻对海南长臀鮠的增重率（WGR）、特定生长率（SGR）等有显著提高（P＜0.05），饵料系数(FCR)随着钝顶螺旋藻的增加显著降低（P＜0.05）。沈子伟[11]在试验中使用螺旋藻饲养鳗鲡，生长、健康状态良好，体型、体重等指标比对照组均显著提升（P＜0.05）。本文中随着钝顶螺旋藻比例的增加试验鱼体重等指标随之升高，与前人试验结果相同。韦公远[12]通过对水生动物如蟹苗、扇贝等的培育表明钝顶螺旋藻含有及其丰富的蛋白质，且极易吸收，能够提高蛋白质的利用效率。本试验中蛋白质效率1.6%和3.2%组均比0%显著提高（P＜0.05），与前人试验结果相同。试验中试验鱼可能是由于螺旋藻脂肪、糖分含量太少，致使肥满度差异不显著（P＞0.05）。王启伦[4]试验结果与推论与本试验相同。

3.2 添加不同比例钝顶螺旋藻对异育银鲫血浆及肝胰脏抗氧化指标的影响

总超氧化物歧化酶（T-SOD）对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，通过清除超氧阴离子自由基（O2-·）保护细胞免受损伤[13]。本次试验结果表明，添加0.8%、1.6%、3.2%的钝顶螺旋藻能不同程度提升异育银鲫血浆和肝胰脏中SOD活力，这说明钝顶螺旋藻有增强SOD活力，清除异育银鲫体内自由基的作用。这与左绍远[14]、曹颖莉等[15]和赵飞艳[16]报道的螺旋藻多糖对小鼠血清和肝胰脏SOD的结论相似。

过氧化氢酶（CAT）是能够催化过氧化氢来分解成氧和水的酶，通过把SOD 反应生成的过氧化氢产物进一步催化成水，从而彻底清除生物体内的自由基[17]，减少自由基对机体的损害。与谷胱甘肽过氧化物酶共同保护巯基酶和膜蛋白，使细胞膜在过氧化作用下免受损坏[18]。本试验中，与0%钝顶螺旋藻添加组相比，添加0.8%、1.6%、3.2%钝顶螺旋藻的异育银鲫血浆及肝胰脏中的CAT活力显著提高，这说明钝顶螺旋藻显著提高异育银鲫血浆及肝胰脏的过氧化氢酶活力，增加机体的抗氧化能力，这与Thaakur S R等[19]的结论相符。

生物体消耗分解能量物质从而大量产生氧自由基，机体不能及时清除，氧自由基在体内堆积后导致脂质产生过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物，机体内的丙二醛（MDA）含量能够反映出机体内脂质物过氧化反应的程度，同时间接地反映出细胞损伤的程度。

试验结果显示，3.2%钝顶螺旋藻添加组的血浆MDA 含量比0%钝顶螺旋藻添加组有显著下降，表明钝顶螺旋藻能降低脂质过氧化物在机体内的累积，这与曹颖莉等[15]和赵飞艳[16]的研究结果一致。

试验结果中添加钝顶螺旋藻组的异育银鲫血浆及肝胰脏的总抗氧化能力（T-AOC）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力与添加0%钝顶螺旋藻组相比无明显变化，这可能与试验周期、研究品种和钝顶螺旋藻添加量等条件的不同有关。

3.3 添加不同比例钝顶螺旋藻对异育银鲫血浆及肝胰脏非特异性免疫的影响

生物体内的碱性磷酸酶(AKP)是一种重要的代谢调控酶，直接参与磷酸基团的转移，在免疫反应中发挥作用[20]。ACP 与溶酶体生理功能的正常发挥密切相关[21]。AKP 和ACP 在蛋白酶的去磷酸化过程中起着关键的作用，它们是生物体内解毒体系的重要组成部分[22]。本试验显示，钝顶螺旋藻添加量为3.2%时，异育银鲫血浆及肝胰脏的AKP活力能显著提高，这与董学兴等[23]报道螺旋藻能增强异育银鲫的非特异性免疫机能的研究趋势一样。

3.4 添加不同比例钝顶螺旋藻对异育银鲫肝功能的影响

血清中的GOT 和GPT 活性大小是最能显示肝细胞受损的指标，从而判定肝胰脏是否受到损伤。如果当机体的组织中毒后产生了病变或是受到了损伤时，细胞生物膜的通透性会导致增加，此时GOT和GPT会被大量的释放到血液中[24]，血清中的GOT和GPT活性被增强。从试验结果来看，与添加0%钝顶螺旋藻组相比，添加1.6%、3.2%钝顶螺旋藻的异育银鲫血浆中GOT和GPT的活力显著降低，这说明钝顶螺旋藻对肝功能有一定增强作用，这与吕子君等[18]的研究结果一致，螺旋藻对肝胰脏有保护作用。其中添加3.2%的钝顶螺旋藻效果最为明显，分别使GOT和GPT活力分别下降30%和40%以上。而添加0.8%钝顶螺旋藻使异育银鲫血浆中的GOT和GPT活力升高，有可能是因为试验对象不同及添加的螺旋藻差异造成的。

3.5 添加不同比例的钝顶螺旋藻对异育银鲫肠道消化酶活力的影响

消化酶是生物中不可缺少的一种蛋白质，消化酶具有高度催化功能和专一性，肠道消化酶可促进食物中糖、脂肪、蛋白质的水解。

已有试验表明，微藻中的活性成分可以调节消化酶的活性，不同浓度的微藻活性成分能够提高或抑制消化酶的活性[25]。公绪鹏等[26]在试验中表明蛋白质和能量交互作用使蛋白酶活力、淀粉酶活力等显著升高（P＜0.05），钝顶螺旋藻中蛋白质含量高达60%，能够提高基础饲料的蛋白质含量。本试验中蛋白酶活力随钝顶螺旋藻添加比例的增加呈增加趋势，且1.6%和3.2%组与0%组相比差异显著（P＜0.05），与前人结果相似。宁博[27]研究表明Na+、K+、Ca2+对血鹦鹉、唇骨鱼的脂肪酶活力多为抑制作用。本试验脂肪酶活力在1.6%、3.2%组受到抑制，与0%组相比显著降低（P＜0.05），可能是因为螺旋藻中含有较为丰富的Na+、K+、Ca2+、Fe2+等离子，故对脂肪酶活力存在抑制作用[28]。

4 结论

在本试验条件下，钝顶螺旋藻可以提高异育银鲫抗氧化力和非特异性免疫机能，有效促进异育银鲫的生长和提升蛋白酶活力，同时钝顶螺旋藻具有降低肝胰脏毒性的功效，添加钝顶螺旋藻在3.2%时效果明显。