柑 橘 渣 中 柚 皮 苷 的 提 取 纯 化 工 艺

王 敬 齐仁立 邱晓宇 孙 倩 黄金秀 王 琪

（重庆市畜牧科学院，重庆402460）

柚皮苷（Naringin，也称为柚苷、柑橘苷、异橙皮苷）是一种二氢黄酮类化合物，含有多个芳香族羟基，主要存在于柚、橘、橙等柑橘类水果的外层果皮中[1]。试验证明它具有抗氧化[2]、降血脂[3]、抗炎[4]和抗癌[5]等多种生物学功效，已有研究表明，柚皮苷添加到畜禽饲料中具有调控脂肪代谢，改善肉品质和减少热应激等作用[6-7]，因此柚皮苷是一种新型绿色的饲料添加剂资源。重庆、四川等西南地区是我国柑橘主产区，每年柑橘加工会产生大量副产物——柑橘渣，柑橘渣中含有较多柚皮苷，为柚皮苷的广泛应用奠定了原料基础。人们目前主要通过填埋和倒入江河等方式处理柑橘渣，造成了严重的资源浪费和环境污染。因此，从柑橘渣中提取柚皮苷具有一定的经济和社会价值，但目前还未有相关试验报道。柚皮苷的提取方法主要有溶剂提取、回流提取、超声波辅助提取和微波辅助提取等[8-10]。其中，溶剂提取是应用甲醇、乙醇和氯仿等溶剂在一定温度下将柑橘渣浸泡一定时间，使柚皮苷溶解于溶剂之中，从而达到提取目的。此法操作简单，成本低廉，适用于工业生产。超声波辅助提取则是在溶剂提取的基础上，利用超声所产生的空化、搅拌和震动等效应，使柚皮苷的提取更为快速和高效。此法具有提取时间短，产率高等优点，但要求较高的设备配置，但随着相应设备的普及，超声波辅助提取将会有较大的前景。柚皮苷提取后，还需进行分离纯化，分离纯化方法主要有柱层析[11]、超滤技术[12]和大孔树脂吸附法[13]等。其中大孔树脂吸附法稳定性好，耐化学腐蚀，可重复使用，适用于工业生产[14]。因此，本试验采用溶剂（乙醇）提取法和超声波辅助提取法从柑橘渣中提取柚皮苷，并通过单因素试验和正交试验确定两者的最优工艺参数。然后通过吸附解吸试验，筛选出最适宜分离纯化柚皮苷的大孔树脂及工艺条件。为高效提取纯化柚皮苷提供参考工艺，增加柚皮苷产量，使得柚皮苷作为一种新型绿色添加剂在饲料生产中发挥重要价值。

1 材料与设备

柑橘渣（选取新鲜柑橘渣于50 ℃烘箱中烘至48 h，粉碎后过40 目筛，用自封袋收集并密封保存于-20 ℃冰箱备用）；无水乙醇、氢氧化钠均为分析纯，重庆川东化工有限公司；柚皮苷标准品，Solarbio公司；大孔树脂(HPD600、AB8、HPD100、HP20、D101)，河北翔蓝化工有限公司。

101 型电热鼓风烘箱，北京市永光明医疗仪器有限公司；FW80高速万能研碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；标准检验筛，浙江上虞市肖金筛具厂；DK-8D三温三控恒温水浴锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；KQ-500DE 型数控超声波清洗仪，江苏省昆仑山市超声仪器有限公司；BIOTEK-H1 紫外分光光度计，中国香港基因有限公司。

2 试验方法

2.1 柚皮苷的含量测定

2.1.1 柚皮苷标准曲线方程的建立

参考许鹭[15]的方法，准确称取80 mg 柚皮苷标准品，无水乙醇定容至50 ml 容量瓶中，得0.16 g/l 柚皮苷标准溶液。分别吸取0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 ml上述溶液于10 ml 比色管中，依次加入无水乙醇5 ml和4 mol/l NaOH 溶液0.1 ml，然后加蒸馏水补充至刻度线，充分摇匀后于40 ℃恒温水浴锅中水浴10 min，迅速冷却后于420 nm 处测定吸光度，设定3 个平行，取平均值。以柚皮苷浓度X为横坐标，吸光度Y为纵坐标作图，拟合得到标准曲线的线性方程为：Y=33.348X-0.001 2，R2=0.999 9。

2.1.2 柚皮苷提取率的计算

准确称取柑橘渣粉末（w）进行提取，过滤后定容至50 ml 容量瓶中，准确吸取一定体积（v）滤液至10 ml 比色皿中，依次加入无水乙醇5 ml 和4 mol/l NaOH溶液0.1 ml，然后加蒸馏水补充至刻度线，充分摇匀后于40 ℃恒温水浴锅中水浴10 min，迅速冷却后于420 nm处测定吸光度，对应柚皮苷标准曲线，计算得到稀释液的浓度（C），按公式（1）计算提取率。设定3个平行，取平均值。

式中：C——稀释液中柚皮苷浓度（mg/ml）；

V——提取液用量（ml）；

W——柚皮粉末质量（g）。

2.2 乙醇提取

2.2.1 乙醇提取单因素试验设计

准确称取柑橘渣粉末0.500 g，在一定的试验条件下分别考察不同水平乙醇体积分数、料液比、提取时间和提取温度对柚皮苷提取率的影响，确定各因素正交设计试验的考察范围。

用乙醇体积分数70%，料液比1∶25 g/ml，提取时间1 h，提取温度60 ℃作为进行单因素筛选试验的基础条件。当研究某一单因素时，其他条件保持不变。

2.2.2 乙醇提取正交试验设计

根据单因素考察试验结果，对乙醇体积分数、料液比、提取时间和提取温度这4个因素进行正交试验，每个因素选择3个水平值，依照L9（34）正交表安排试验。

2.3 超声波辅助提取

2.3.1 超声波辅助提取单因素试验设计

准确称取柑橘渣粉末0.500 g，在一定的试验条件下分别考察乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取温度和超声波频率对柚皮苷提取率的影响，确定各因素正交设计试验的考察范围。

用乙醇体积分数70%，料液比1∶40 g/ml，提取时间30 min，提取温度60 ℃，提取功率400 W作为进行单因素筛选试验的基础条件。当研究某一单因素时，其他条件保持不变。

2.3.2 超声波辅助提取正交试验设计

根据单因素试验结果，对乙醇体积分数、料液比，提取时间，提取温度和超声波功率这5个因素进行正交试验，每个因素选择4个水平值，依照L16(45)正交表安排试验。

2.4 柚皮苷的纯化工艺

2.4.1 大孔树脂的筛选

本试验选择了HPD600、AB8、HPD100、HP20 和D101 共5 种大孔树脂，通过吸附和解吸试验，筛选出最适合纯化柚皮苷的大孔树脂。

2.4.1.1 大孔树脂预处理

用95%乙醇浸泡树脂24 h，使树脂充分溶胀。采用湿法装柱，用乙醇洗至流出液不呈白色浑浊现象，用蒸馏水洗去乙醇。用2%的NaOH溶液以2 BV/h的流速通过树脂柱，蒸馏水洗至中性。再用5% HCl 溶液以2 BV/h 的流速通过树脂柱，最后用蒸馏水以2 BV/h的流速洗至中性。

2.4.1.2 大孔树脂试验

参照许鹭[15]的方法，准确称取5种树脂各3.0 g于50 ml 锥形瓶中，加入已知浓度（C1）的柚皮苷提取液20 ml（V1），将锥形瓶封口后置于恒温振荡器上振荡吸附12 h，振荡温度为40 ℃，振荡频率为100 r/min。充分吸附后过滤，测定滤液中柚皮苷浓度（C2）。按公式（2）计算吸附率E。

再将吸附饱和的树脂置于50 ml 锥形瓶中，加入0.05 mol/l Na0H 溶液30 ml，置于振荡器上振荡解吸12 h，然后测定溶液（V3）中柚皮苷的浓度（C3）。按公式（3）计算解吸率D。

式中：E——吸附率（%）；

C1——提取液初始浓度（mg/ml）；

C2——吸附后提取液浓度（mg/ml）；

D——解吸率（%）；

C3——解吸后提取液浓度（mg/ml）；

V3——解吸液体积（ml）；

V1——提取液体积（ml）。

2.4.2 大孔树脂纯化工艺参数

筛选出最适合纯化柚皮苷的大孔树脂后，将此种树脂按2.4.1.1 的方法预处理后湿法装柱。选用5 个相同型号的柱子，分别装入3.0 g 大孔树脂。将柚皮苷提取液上柱，考察吸附时间、样品液pH 值、上样流速对柚皮苷吸附率的影响；对已吸附饱和的大孔树脂进行解吸试验，考察洗脱液浓度、洗脱流速对柚皮苷解吸率的影响。通过上述吸附和解吸试验，筛选出大孔树脂的最优工艺条件。

3 试验结果与分析

3.1 乙醇提取法

3.1.1 乙醇提取单因素试验

（1）提取时间（见图1）：随着提取时间增加，柚皮苷提取率逐渐升高。但与2.5 h 的柚皮苷提取率相比，3.5 h和5.0 h的柚皮苷提取率并未增加多少，由此确定2.5 h为最佳提取时间。

图1 提取时间对柚皮苷提取率的影响

（2）料液比（见图2）：料液比达到1∶40 g/ml 以后，柚皮苷提取率基本不再上升。从成本的角度考虑，选择1∶40 g/ml为最佳料液比。

图2 料液比对柚皮苷提取率的影响

（3）乙醇体积分数(见图3)：乙醇体积分数为70%时，柚皮苷提取率达到最大值，继续增加乙醇体积分数，柚皮苷提取率开始下降，由此确定70%为最佳乙醇体积分数。

（4）提取温度（见图4）：随着提取温度的升高，柚皮苷提取率逐渐上升，80 ℃时柚皮苷提取率达到最大值。由此确定最适提取温度为80 ℃。

3.1.2 乙醇提取正交试验

基于单因素试验结果，以提取时间、料液比、乙醇体积分数、提取温度4个因素进行正交试验。因素水平见表1，正交试验结果见表2，方差分析见表3。

图3 乙醇体积分数对柚皮苷提取率的影响

图4 提取温度对柚皮苷提取率的影响

表1 乙醇提取因素水平

表2 乙醇提取正交试验结果

表3 乙醇提取方差分析

通过极差分析（表2）可知，在正交试验条件下，4个因素对柚皮苷提取率的影响从大到小依次是：提取温度＞料液比＞提取时间＞乙醇体积分数。根据方差分析（表3）结果，提取时间、料液比和提取温度对柚皮苷提取率的影响差异显著，乙醇体积分数对柚皮苷提取率的影响差异不显著。综上，乙醇提取法的最优工艺参数为A3B3C1D3，即提取时间3.5 h，料液比1∶45 g/ml，乙醇体积分数65%，提取温度80 ℃。在此工艺参数下，柚皮苷提取率为15.09 mg/g。

3.2 超声波辅助提取

3.2.1 超声波辅助提取单因素试验

（1）乙醇体积分数（见图5）：随着乙醇体积分数的增加，柚皮苷提取率逐渐升高，在乙醇体积分数为70%时，柚皮苷提取率处于最高水平。由此确定最适乙醇提取分数为70%。

（2）料液比（见图6）：随着料液比逐渐增加，柚皮苷提取率也逐渐升高，当料液比达到1∶60 g/ml 时，柚皮苷提取率基本不再升高。由此确定最适料液比为1∶60 g/ml。

（3）提取时间（见图7）：提取时间增加，柚皮苷提取率也在逐渐上升，但在70 min 以后，提取率并未增加太多，考虑到工作效率的问题，确定70 min 为最佳提取时间。

图5 乙醇体积分数对柚皮苷提取率的影响

图6 料液比对柚皮苷提取率的影响

图7 提取时间对柚皮苷提取率的影响

（4）提取温度（见图8）：提取温度升高，柚皮苷提取率逐渐上升，80 ℃时柚皮苷提取率达到最大值。由此确定最适提取温度为80 ℃。

图8 提取温度对柚皮苷提取率的影响

（5）超声波频率（见图9）：随着超声波频率增加，柚皮苷提取率也在上升，当超声波频率达到450 W时，柚皮苷提取率基本不再升高。由此确定最适超声波频率为450 W。

图9 超声波频率对柚皮苷提取率的影响

3.2.2 超声波辅助提取正交试验

基于单因素试验结果，以乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取温度、超声波频率5个因素进行正交试验。因素水平见表4，正交试验结果见表5，方差分析见表6。

表4 超声波辅助提取因素水平

通过极差分析（表5）可知，在正交试验条件下，5 个因素对柚皮苷提取率的影响从大到小依次是：超声波频率＞乙醇体积分数＞提取温度＞料液比＞提取时间。根据方差分析（表6）结果，超声波频率、乙醇体积分数、提取温度和料液比对柚皮苷提取率的影响差异显著，提取时间对柚皮苷提取率的影响差异不显著。综上得到超声波辅助提取法的最优工艺参数为A2B4C4D4E4，即乙醇体积分数70%，料液比1∶60 g/ml，提取时间90 min，提取温度80 ℃，超声波频率500 W。在此工艺参数下，柚皮苷提取率为24.15 mg/g。

3.3 柚皮苷的纯化工艺

3.3.1 大孔树脂的筛选

表5 超声波辅助提取正交试验结果

表6 超声波辅助提取方差分析

表7 大孔树脂的吸附率和解吸率比较

如表7所示，大孔树脂HPD600的吸附率最高，解吸率仅低于HPD100；HPD100 的解吸率最高，但其吸附率很低。综合吸附率和解吸率，大孔树脂HPD600的效果最佳，是最适合纯化柚皮苷的大孔树脂。

3.3.2 大孔树脂纯化工艺参数

图10 吸附时间对柚皮苷吸附率的影响

3.3.2.1 吸附时间对柚皮苷吸附率的影响(见图10)由图10 可知，在0.5～4.0 h 范围内，大孔树脂HPD600对柚皮苷的吸附率随着吸附时间增加有较为显著的提高，在4.0 h 时达到最大值。随着吸附时间的继续增加，柚皮苷的吸附率基本保持不变，吸附时间为4.0 h是比较理想的选择。

3.3.2.2 样品pH值对柚皮苷吸附率的影响(见图11)

图11 样品pH值对柚皮苷吸附率的影响

由图11可知，当样品pH值为4时，大孔树脂对柚皮苷的吸附率达到最大值。随着样品pH 值的增加，吸附率逐渐降低。因此，样品pH 值为4 最适合大孔树脂纯化。

3.3.2.3 上样流速对柚皮苷吸附率的影响(见图12)

图12 上样流速对柚皮苷吸附率的影响

由图12可知，随着上样流速的增加，柚皮苷吸附率逐渐降低，当上样流速为1 BV/h 时，柚皮苷吸附率最大。但在实际生产中还应考虑到时间成本，因此本试验选择2 BV/h为最佳上样流速，这样既能保证较高的吸附率，又能减少整体时间消耗。

3.3.2.4 洗脱液浓度对柚皮苷解吸率的影响(见图13)

图13 NaOH浓度对柚皮苷解吸率的影响

由图13可知，当洗脱液NaOH的浓度为0.05 mol/l时，柚皮苷解吸率达到最大值。随着洗脱液浓度增加，柚皮苷解吸率逐渐降低。NaOH浓度为0.05 mol/l是适合大孔树脂纯化的参数。

3.3.2.5 洗脱流速对柚皮苷解吸率的影响(见图14)

由图14可知，随着解吸流速的增加，柚皮苷解吸率逐渐减低，当解吸流速为1 BV/h 时，柚皮苷解吸率最大。但在实际生产中还应考虑到时间成本，因此本试验选择2 BV/h为最佳解吸流速。

4 结论

采用乙醇提取法提取柑橘渣中柚皮苷的最优工艺参数为：提取时间3.5 h，料液比1∶45 g/ml，乙醇体积分数65%，提取温度80 ℃。在此条件下，柚皮苷提取率为15.09 mg/g。采用超声波辅助提取法提取柑橘渣中柚皮苷的最优工艺参数为：乙醇体积分数70%，料液比1∶60 g/ml，提取时间90 min，提取温度80 ℃，超声波频率500 W。在此条件下，柚皮苷提取率为24.15 mg/g。通过比较5 种大孔树脂对柚皮苷的吸附和解吸率，HPD600具有良好的吸附和解吸效果，是最适合纯化柚皮苷的大孔树脂。HPD600的最优工艺条件为：吸附时间4.0 h，样品pH值4，上样流速2 BV/h，洗脱液浓度0.05 mol/l，解吸流速2 BV/h。

图14 洗脱流速对柚皮苷解吸率的影响

乙醇提取和超声波辅助提取均能获得较高浓度的柚皮苷，以乙醇替代酸碱[16]和有毒有害有机溶剂[17]的使用，毒害作用小，方法简便，成本低廉，适用于工业生产。HPD600 具有良好的吸附和解吸效果，适用于柚皮苷的分离纯化。有研究发现，在肉鸡的饲料中添加0.15%柚皮苷能降低鸡肉中氧化产物丙二醛的含量，增加鸡肉抗氧化力，此外，柚皮苷减少了胸肌中棕榈酸的含量，增加了多不饱和脂肪酸的含量[18]。也有试验表明，0.5%柚皮苷能提升猪肉肉色红度，使得猪肉品质有所提升[19]。上述研究提示，柚皮苷具有提高肌肉抗氧化性能、调控脂肪代谢和改善肉品质等生物学功能，适合作为饲料添加剂或者动物保健药品在饲料工业中应用。综上，柑橘渣中柚皮苷的提取纯化工艺，为饲料工业中柚皮苷的高效获取提供了参考方法，这为柚皮苷在饲料中的广泛应用奠定了基础。