博落回茎叶血根碱提取工艺的比较研究

曹华亮 曾建国 董新荣 谢红旗

（1.湖南农业大学中兽药湖南省重点实验室，湖南长沙410128；2.湖南农业大学园艺园林学院，湖南长沙410128；

3.湖南美可达生物资源股份有限公司，湖南浏阳410331；4.湖南农业大学理学院，湖南长沙410128）

我国植物提取物是从中药产业分化出来的新兴领域，由于其指标成分往往能在作用机理和现代药理中找到良好对接点，可以作为中药国际化的桥梁产品在国际市场上流通，目前已探索出以“两个标准，三个规程”理论作为技术路线可以有效控制植物提取物生产过程使其标准化[1]。近年来，饲用抗生素的滥用导致病菌产生耐药性已形成业界共识[2]，博落回[Macleaya Cordata（Willd）R. Br]提取物具有调节动物肠道菌群、抗炎促生长等作用[3-4]，且使用后安全有效等特点引起人们的广泛关注。目前，博落回提取物已被多个国家作为饲用促生长抗生素替代产品，也是我国首个天然植物源药物饲料添加剂[5]。

目前，标准的博落回血根碱提取物是以果荚为原料，博落回果荚虽然血根碱含量较高，但资源有限[6-7]。为实现博落回资源综合利用，从博落回茎叶部位也获得含血根碱的提取物，是对血根碱的有益补偿。随着市场对博落回提取物的需求日益增长，开发茎叶提取血根碱的方法，符合市场增长的需求，也可以提高博落回资源利用率。本文研究了博落回茎叶的血根碱提取工艺，对酸性乙醇回流和酸水渗漉提取两种方法进行比较，以此获得利用两种方法提取博落回茎叶的最佳工艺参数以及血根碱转移率，对后期开发利用博落回茎叶具有重要的参考意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

原料为河南洛阳未开花的博落回干燥茎叶，采收时间为2018年4月～2018年5月。

1.2 主要试剂

盐酸血根碱对照品(≥98%，批次：140708)由湖南美可达生物资源股份有限公司提供；水为蒸馏水；乙腈为色谱纯，其它试剂均为分析纯。

1.3 主要仪器

YB-1500A 型高速多功能粉碎机(永康市速锋工贸有限公司)；PL203 电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；DK-98-IIA 电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)；KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；安捷伦1260 Infinity II液相色谱仪[安捷伦科技(中国)有限公司]。

1.4 试验方法

1.4.1 检测方法参照《农业部1597号公告》[8]。具体色谱条件为：Agilent ZORBAX SB-C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），进样量5 μl，体积流量0.8 ml/min，检测波长270 nm，柱温35 ℃，流动相乙腈A-0.2%三乙胺（磷酸调节pH 值至2.5）B，梯度洗脱（0～14 min，25% A；14～27 min，25%～60% A；27～35 min，60%～90% A；35～37 min，60%～25% A；37～43 min，25%～25% A）。

1.4.2 对照品溶液配制

精密称取16.12 mg 盐酸血根碱标准品，加入MeOH∶1% HCl=1∶1 溶液(v/v，C 液)完全溶解，定量转移至50 ml 容量瓶中，以C 液定容，得到322.4 mg/l标准品贮备液。吸取适量连续稀释，分别得到质量浓度为322.4、161.2、80.60、40.30、20.15、10.08 mg/l 的对照品溶液。

1.4.3 酸性乙醇回流提取

取博落回干燥茎叶粉碎过16 目筛。称取适量置于圆底烧瓶中，加入适量含硫酸的乙醇水溶液，适度温度下水浴回流提取一定时间，抽滤得滤液，回收溶剂得浸膏，记录浸膏质量。将浸膏用C液完全溶解并定容至250 ml，经0.45 μm 滤膜过滤，按“1.4.1”项色谱条件下进行检测，记录峰面积，根据回归方程得到提取液中血根碱的质量浓度。

1.4.3.1 单因素考察

取原料5.0 g，分别考察乙醇体积分数(0、20%、40%、60%、80%、90%)、液固比(15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1 ml/g)、硫酸浓度(0%、0.04%、0.08%、0.12%、0.16%)、提取温度(50、60、70、80、90 ℃)、提取时间(1、2、3、4、5 h)对血根碱的转移率的影响。

1.4.3.2 响应面法优化

在单因素考察酸性乙醇回流提取血根碱的结果基础上，选取乙醇体积分数(A)、液固比(B)、提取温度(C)、提取时间(D)为自变量，以血根碱转移率(Y)为因变量，进行4因素3水平的Box-Behnken 试验设计，并利用响应面分析法对酸性乙醇回流法提取博落回茎叶中血根碱的工艺条件进行优化。试验因素与水平设计见表1。

表1 酸性乙醇回流提取响应面试验设计

1.4.4 酸水渗漉提取

取博落回干燥茎叶粉碎过16目筛。称取适量置于烧杯中，加入5倍体积稀硫酸溶液浸泡一定时间后转移至渗漉柱中，逐渐加入同浓度硫酸溶液以一定流速进行渗漉提取，收集渗漉液。回收溶剂后复溶，定容至刻度，取上清液经0.45 μm 滤膜过滤，按“1.4.1”项色谱条件下进行检测，记录峰面积，根据回归方程得到渗漉液中血根碱的质量浓度。

1.4.4.1 单因素考察

取原料5.0 g，分别考察硫酸浓度(0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%)、渗漉温度(20、40、60、80、90 °C)、浸泡时间(30、60、90、120、150 min)、溶剂用量(10、20、30、40、50 倍)、渗漉速度(0.5、1、1.5、2、2.5 ml/min)对血根碱的转移率的影响。

1.4.4.2 正交试验优化

在单因素考察酸水渗漉提取血根碱的结果基础上，以血根碱转移率(Y)为考察指标，选取硫酸浓度(A)、浸泡时间(B)、溶剂用量(C)、渗漉速度(D)为考察因素，采用L9(34) 正交表进行正交试验设计，并利用方差分析法得到酸水渗漉法提取博落回茎叶中血根碱的最佳工艺条件。试验因素与水平设计见表2。

表2 酸水渗漉提取正交试验设计

1.5 指标计算公式

血根碱转移率(Y)按公式进行计算：

式中：C1——提取液中血根碱的浓度(mg/l)；

C2——原料中血根碱的含量(mg/g)；

V——提取液体积(ml)；

M——博落回茎叶质量(g)。

2 结果与分析

2.1 血根碱的分析

血根碱对照品在“1.4.1”项色谱条件下检测，以峰面积积分值(Y)为纵坐标，血根碱质量浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线（见图1），其回归方程：Y=18 518X-34.223 (n=6，R2=0.999 9)。结果表明血根碱溶液在10.08～322.4 mg/l 质量浓度范围内与峰面积呈良好线性关系。

图1 SAN标准曲线

2.2 酸性乙醇回流提取

2.2.1 单因素条件（见图2）

图2 酸性乙醇回流提取

乙醇体积分数对血根碱转移率的影响，血根碱转移率随着乙醇体积分数的增加呈持续上升趋势。因此，固定乙醇体积分数为90%。液固比对血根碱转移率的影响，血根碱转移率一开始随着液固比的增大而迅速上升，当液固比到达25∶1 ml/g之后变为平缓。血根碱在液固比为25∶1 ml/g 时的转移率已达到了液固比30∶1 ml/g 时的95.3%。因此，固定液固比为25∶1 ml/g。硫酸浓度对血根碱转移率的影响，不加硫酸时对血根碱的提取效果不理想，血根碱转移率随着硫酸浓度的增加而上升，在硫酸浓度为0.12%时达到最大，说明硫酸根离子与血根碱结合达到饱和状态。因此，固定硫酸浓度为0.12%。提取温度对血根碱转移率的影响，血根碱转移率一开始随着水浴温度的增加而上升，达到70 ℃后呈缓慢上升趋势。水浴温度增加到80 ℃以后血根碱转移率不再随温度的增加而上升。血根碱在水浴温度为70 ℃时的转移率达到了水浴温度为80 ℃的96.3%。因此，固定提取温度为70 ℃。提取时间对回流提取博落回茎叶中血根碱转移率的影响，提取时间较短时，血根碱未被提取完全，血根碱的转移率不高。提取时间超过2 h 后，转移率增加趋势变缓，血根碱在提取时间为2 h 时的转移率以达到了提取时间为5 h的95.5%。因此，固定提取时间为2 h。

2.2.2 响应面试验

2.2.2.1 设计结果

利用软件Design-Expert 8.0.6 Trial 进行Box-Behnken 设计，对乙醇回流提取法进行工艺优化。试验结果见表3。

表3 酸性乙醇回流提取响应面试验设计与结果

对试验结果进行多元回归拟合分析，得到血根碱转移率与各因素变量的二次方程模型为Y=82.14+2.31A+2.17B+5.3C+3.59D+1.43AB+2.25AC-0.25AD+1.62BC+0.33BD-3.52CD-1.25A2-2.51B2-2.87C2-1.3D2。

2.2.2.2 方差分析

对回归方程进行显著性检验及方差分析，结果见表4。

从表4 可知，回归模型F 值为9.29，概率P＜0.000 1，表明模型极显著；而失拟项不显著(P=0.169 4＞0.05)，表明所建模型拟合度良好，能替代试验真实点解释响应结果；模型的变异系数(CV)为3.11%，信噪比为12.651，均在可接受范围内，R2=0.902 8，表明90.28%响应值变化可以用此模型解释，可进行分析和预测。各因素一次项和二次C2的P 值均达到极显著水平(P＜0.01)，且交互项CD 和二次项B2均达到显著水平(P＜0.05)，即各因素对响应值的影响不是简单的线性关系，而是存在一定的交互作用。各因素对血根碱转移率的影响依次为C(提取温度)＞D(提取时间)＞A(乙醇体积分数)＞B(液固比)。

表4 酸性乙醇回流提取方差分析

2.2.2.3 响应面分析

通过Box-Behnken 试验结果得到各个因素间交互的作用对血根碱转移率影响的响应面图，结果见图3。响应面图坡度越陡峭，等高线图越接近椭圆，则表明该因素对响应值得影响越显著，反之则表明该因素对响应值的影响不显著。

图3 各因素响应面图

由图3(f)可知，响应曲面开口向下，坡度陡峭，等高线呈椭圆形，说明提取温度与提取时间对血根碱转移率具有很强的交互作用，呈显著性影响；其它曲面图较为平缓，等高线接近圆形，说明两因素间无明显交互影响。响应曲面图与方差分析结果一致，模型可靠。

2.2.3 验证试验

通过回归模型预测，得到从博落回茎叶中提取血根碱的最佳工艺条件为：乙醇体积分数90%，液固比30∶1 ml/g，硫酸浓度0.12%，提取温度80 ℃，提取时间2.07 h。在此条件下，血根碱转移率理论上可达90.60%。考虑操作的实际情况，将优化工艺条件修改确定为：乙醇体积分数90%，液固比30∶1 ml/g，硫酸浓度0.12%，提取温度80 ℃，提取时间2 h。按上述修正后的提取条件进行茎叶提取，血根碱平均转移率为(89.36±0.49)%(n=5，R2=0.54%)，与预测值90.60%相吻合，提取效果理想。

再将提取液回收溶剂至无醇味，加入10 倍水溶解完全后过滤，滤液用Ca(OH)2调节pH 值至9 使血根碱完全沉淀，离心得沉淀，干燥后得到博落回茎叶提取物，最终收率为(24.27±0.92)%(n=5，R2=3.77%)，提取物中血根碱的含量为(1.65±0.06)%(n=5，R2=3.36%)。

2.3 酸水渗漉提取

2.3.1 单因素条件

硫酸浓度对血根碱转移率的影响，结果见图4(A)。血根碱转移率随着硫酸浓度的增加一开始迅速提高之后变为平缓，当硫酸浓度为1%时血根碱转移率为最高值的98.8%。因此，硫酸浓度为1%。渗漉温度对血根碱转移率的影响，结果见图4(B)。温度对渗漉法提取博落回茎叶血根碱的影响较大，血根碱的转移率随着温度的增加而提高，当温度达到80 °C后，血根碱转移率上升不明显。因此，固定渗漉温度为80 ℃。浸泡时间对血根碱转移率的影响，结果见图4(C)。浸泡时间对血根碱转移率的影响不明显。因此，固定浸泡时间为30 min。溶剂用量对血根碱转移率的影响，结果见图4(D)。溶剂用量为30 倍后血根碱转移率上升趋势较为平缓，已达到最高值的90.5%。因此，固定溶剂用量为30 倍。渗漉速度对血根碱转移率的影响，结果见图4(E)。血根碱转移率随着渗漉速度的加快呈下降趋势，表明渗漉速度越快提取效果越不理想。因此，固定渗漉速度为0.5 ml/min。

2.3.2 正交试验

采用L9(34) 正交表对渗漉法提取博落回茎叶中血根碱的提取工艺进行正交试验设计，试验结果见表5。并利用软件SPSS 23.0 对表5 进行方差分析，结果见表6。

正交试验极差R 的大小与该因素对血根碱转移率的大小成正比。由表5可知，正交试验极差(R)分析可得渗漉提取法对血根碱转移率的影响大小为：C(溶剂用量)＞D(渗漉速度)＞A(硫酸浓度)＞B(浸泡时间)，由表6可知因素C对渗漉法提取博落回茎叶中血根碱转移率影响具有极显著作用，因素D 具有显著作用，其他因素对其影响不显著。极差R 值相对较小的因素A、B，再结合单因素考察渗漉提取条件，综合考虑时间、经济成本等实际生产条件，确定最佳渗漉提取工艺为：A2B1C3D1，即以1%硫酸为渗漉液，浸泡时间30 min，溶剂用量30倍，渗漉速度0.5 ml/min。

图4 酸水渗漉提取各条件对博落回茎叶血根碱转移率的影响

2.3.3 验证试验

在正交试验结果得到的最佳渗漉提取工艺条件下进行稳定性验证试验，重复5次。得到血根碱平均转移率为(83.63±2.09)%(n=5，R2=2.49%)。表明提取工艺条件合理，稳定可行。

再将酸水渗漉提取得到的渗漉液加Ca(OH)2调节pH 值至9 使血根碱完全沉淀下来，离心得沉淀，干燥后得到博落回茎叶提取物，最终收率为(21.64±0.78)%(n=5，R2=3.61%)，提取物中血根碱的含量为(2.25±0.11)%(n=5，R2=4.88%)。

表5 渗漉提取正交试验设计与结果

表6 渗漉提取方差分析

3 结论

博落回提取物具有调节动物肠道菌群、促生长等作用[6]，被多个国家作为饲用饲料添加剂应用于动物生产，在替代饲用促生长抗生素方面效果显著[9]。目前，有关博落回血根碱的提取研究报道及工业生产均以博落回果荚为原料[10]，存在资源蕴藏量少等问题。由此可见，开发博落回血根碱提取物的原料资源以及提取新工艺，以满足市场对博落回提取物日益增长的需求是十分必要的。

本文分别使用乙醇回流及酸水渗漉法对博落回茎叶血根碱提取工艺进行研究，通过单因素试验确定各个因素水平范围，再分别对工艺进行优化，响应面法优化乙醇回流试验结果：乙醇体积分数为90%，液固比30∶1 ml/g，硫酸浓度为0.12%，提取温度为80 ℃，提取时间为2 h。该条件下血根碱转移率为89.36%。正交试验优化酸水渗漉试验结合单因素试验结果：硫酸浓度为1%，浸泡时间为30 min，渗漉温度为80 ℃，溶剂用量为30倍，渗漉速度为0.5 ml/min。该条件下血根碱转移率为83.63%。通过两种方法用于提取博落回茎叶中血根碱转移率的结果可以看出差异并不大。但在后续碱沉时酸水渗漉法比酸性乙醇回流法操作简便，最终提取物中血根碱的含量可达(2.25±0.11)%(n=5，R2=4.88%)。两种提取方法溶剂用量一致，水相对于乙醇的价格较低，具有不易挥发等特点。工业化生产应结合实际情况进一步优化参数，为博落回茎叶综合利用提供了理论依据和实验基础。