利塞膦酸钠对骨质疏松性骨折大鼠愈合影响及生物力学评价

柯呈辉，何立江，黄俊杰，杜思明，林树峰，白海滨，吴文华

(福建医科大学附属第二医院骨科，福建 泉州 362000)

骨质疏松症(Osteoporosis，OP)是一种以低骨量为特征的疾病，导致骨质恶化和骨骼强度受损。它被认为是引起骨折的主要原因，在美国大约有1 000万50岁以上成人受其影响[1]。据世界卫生组织(WHO)估计，全球每年有166万例髋部骨折发生，预计到2050年该数字将增加4倍[2]。虽然绝经后女性服用双膦酸盐类药物(bisphosphonate drugs，BPs)后典型骨折的发生率有所下降，但非典型骨折的发生率在过去十年中却有所增加[3]。而BPs类药物治疗被认为是预防和治疗OP的第一线，并且已在多项随机对照试验(randomized controlled trial，RCTs)[4-7])中被证明可降低典型髋部骨折的发生率。BPs通过增加骨矿物质密度和预防脆性骨折来实现这一目标[8-10]。然而，长期使用BPs有潜在的严重抑制骨转换的风险，这可能损害骨重塑的能力，最终导致微损伤的累积以及骨韧性的降低和脆性的增加[11-19]。本实验模拟短期内应用BPs类药物对于骨质疏松性骨折(Osteoporotic l fracture，OPF)的愈合影响并进行生物力学分析，探讨BPs类药物与OPF愈合的相关性，为临床OPF后短期应用BPs类药物提供一定的依据。

1 资料与方法

1.1 实验动物

1.1.1 动物 同时期健康6月龄雌性SD大鼠90只，所有动物均购自闽侯县吴氏实验动物贸易有限公司，在实验前适应性喂养1周，室内分组笼养，室温控制在(22±2)℃，8：00～20：00时自然光线照射，其余时间关灯。由专人喂养，自由饮水，并根据大鼠的生长速度调节饲料和饮用水的高度。所有饲料均购自闽侯县吴氏实验动物贸易有限公司。

1.2 试剂和器材 a)利塞膦酸钠胶囊(江苏正大清江制药有限公司，江苏)。b)水合氯醛(CP沪试，≥99.0%，250 g，国药试剂cas302-17-0；上海)。c)克氏针若干，规格为直径1.5 mm。d)DR数字化摄影机(德国，飞利浦公司)。e)骨组织标本制作装置：切片机、载玻片、石蜡等(福建医科大学附属第二医院病理科)。f)双能X线吸收仪(美国，HOLOGIC公司)。g)常规动物手术器械(中国人民解放军第180医院骨科实验室)。h)Endura TEC ELF 3200力学实验仪器及其配套的Wintest生物力学测试软件(Bose公司，美国)。

1.3 实验前称重和摄片 每只大鼠每周称重并记录。实验时间为每天晚上6点到8点。时间为期1.5个月。所有大鼠均在10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射下麻醉。麻醉后拍摄大鼠俯卧位片，将头部和身体摆正后摄片。

1.4 动物分组及模型制作

1.4.1 动物分组 所有大鼠均独立随机分配在动物实验箱里，箱子表面标记A1-A30、B1-B30、C1-C30，每天专人给予饲料喂养，自由饮水，采用相同的照明，并根据大鼠的生长速度调节饲料和饮用水的高度。

1.4.2 大鼠骨质疏松模型建立 a)A组：10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后，选用背侧入路，取脊柱旁开1 cm、髂骨脊上2 cm处为手术切口，纵行切开约1 cm，切开皮肤和皮下组织，分离肌层，暴露双侧卵巢。后逐层关闭切口。严格无菌手术操作，术后连续3d予肌注青霉素80万单位，2次/d。术后笼中自由活动与进食。b)B、C组：10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后，选用背侧入路，取脊柱旁开1 cm、髂骨脊上2 cm处为手术切口，纵行切开约1 cm，切开皮肤和皮下组织，分离肌层，显露腹腔内双侧卵巢，分别切除卵巢后残端结扎，逐层关闭切口。严格无菌手术操作，术后连续3 d予肌注青霉素80万单位，2次/d。术后笼中自由活动与进食。c)BMD值检测：卵巢切除术后4周，在10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉下，检测各组大鼠右侧股骨中段BMD值，各组大鼠前后前后BMD均值对比，结果出现明显差异提示骨质疏松模型建模成功。本实验术后检测中，未见大鼠死亡现象，各组大鼠BMD值测量结果差异均有统计学意义，证明骨质疏松模型造模成功，成功率为100%。d)股骨生物力学性能检测：处死大鼠制作右侧股骨病理标本，采用En-dura TEC ELF 3200力学实验仪器进行4点弯曲试验。顶端跨距为8 mm，底端跨距为20 mm，加载速度为1 mm/min。测量时保持各标本位置一致，并保持标本湿润状态。通过载荷-位移曲线获得最大载荷；以骨折侧股骨最大载荷占对侧非骨折侧股骨最大载荷比例表示骨折载荷恢复率。

1.4.3 OP大鼠骨折模型的制作 a)A组：10%水合氯酸(300 mg/kg)腹腔注射麻醉下，选取右侧股骨中段为手术切口，纵行切开约1 cm，切开皮肤和皮下组织，分离肌层显露股骨，逐层缝合各层组织。严格无菌手术操作，术后连续3 d予肌注青霉素80万单位，2次/d。b)B、C组：10%水合氯酸(300 mg/kg)腹腔注射麻醉下，选取右侧股骨中段为手术切口，纵行切开约1 cm，切开皮肤和皮下组织，分离肌层显露股骨中段，线锯于股骨中段，并横行锯断股骨，选用直径1.5 mm克氏针经髓腔固定骨折断端，逐层缝合各层组织。严格无菌手术操作，术后连续3 d予肌注青霉素80万单位，2次/d。c)给药途径与剂量：B组于骨折术后3 d开始每天给予0.1 mg/kg·d，利塞膦酸钠灌胃治疗；A、C组给予同等剂量0.9%生理盐水灌胃。d)术后第3、6周：各组大鼠在术后第3、6周随机抽取大鼠10只，处死并去除骨折内固定物，制作右侧股骨病理标本，检测右侧股骨骨痂处BMD值，并进行生物力学检测。

2 实验结果

2.1 各检测数值结果 在各组大鼠骨折建模过程中，BMD值进行组间、组内对比情况，建模前各组大鼠组间对比，P>0.05，差异无统计学意义，建模后3周与建模前、建模后6周与建模前各组间、组内比较，均P<0.05，差异有统计学意义。说明利塞膦酸钠可促进骨质疏松性骨折愈合过程中BMD升高。结果见表1。

表1 各组大鼠骨质疏松性骨折建模前后BMD值比较

在各组大鼠骨质疏松性骨折建模前后生物力学性能组间、组内对比情况中，均P<0.05，差异有统计学意义，除了在最大载荷恢复率中，B、C组间对比，P>0.05，差异无统计学意义；在最大载荷中，C组组内对比，P>0.05，差异无统计学意义。说明利塞膦酸钠可增强新生骨痂结构强度和力学强度。结果见表2。

表2 各组大鼠骨质疏松性骨折建模前后生物力学性能比较

3 讨 论

OP是一种骨矿基代谢疾病，其特点主要为骨密度下降、骨矿物质削减，骨小梁稀松，进而致使骨机械强度下降、脆性增高，容易导致病理性骨折。OPF是OP最严重的并发症之一，多发于老年人，发生率较高，因OP的特征故而导致OPF多呈粉碎型，愈合慢。且因骨强度低和骨脆性高而容易引起内固定松动和再骨折发生，故而残疾率和死亡率相对较高[20]。就目前的研究现状来说，BPs类药物成为临床防治OPF最常用的一线药物，其治疗目标是防止进一步的骨质流失，以减少初始或后续骨折的风险，故该类药物的应用显著降低OPF的发生：有文献报道应用BPs后脊柱骨折发生率降低了40%～70%，髋部骨折发生率降低了40%～50%[21]。然而，考虑到BPs类药物的主要作用机制，基于抑制破骨细胞活性和随后抑制骨形成[22]，人们担心它们长期应用是否会延迟或损害骨折愈合的能力[22-26]，甚至引起新发骨折形成。

本实验就是基于这个思考而设计。本实验主要探寻在OPF中，短期使用利塞膦酸钠对于OPF愈合的影响，进而推测长期应用BPs类药物引起新发骨折的可能原因。为临床短期内应用BPs类药物提供一定的依据。因为目前有相关研究表明，有相当一部分患者在发生严重骨质疏松性骨折后才接受了抗骨质疏松药物治疗。例如，Klop等[27]报道在英国人数将近达到了一半(45.5%)。Gillespie等[28]则指出，在美国有17.1%的女性在第一次髋部骨折后才接受了骨质疏松评估和治疗。而根据对日本患者的调查，Hagino等[29]最近证实，大多数髋部脆性骨折的患者没有接受预防第二次骨折的药物治疗。Iba等人[30]对730个骨质疏松患者进行调查，612例(83.8%)患者未接受任何抗骨质疏松症药物治疗，仅有118例(16.2%)患者出院后接受骨质疏松症药物治疗。所以探讨患者发生OPF后，立即短期使用BPs类药物对于骨折愈合的影响具有显著的临床意义。

在本实验的结果中，我们发现大鼠发生OPF后，短期内使用利塞膦酸钠可以促进骨质疏松性骨折愈合过程中骨折处BMD升高，增强骨结构强度和力学强度。这一点可以从BPs类药物的药效动力学方面解释：BPs类药物对骨骼有双重作用。第一种是通过减少由于预防破骨细胞生成和促进破骨细胞凋亡而破坏破骨细胞的数量来阻止骨质流失[31-32]，第二种是在各种病理条件下抑制骨细胞和成骨细胞凋亡[33-34]。利塞膦酸钠作为第三代BPs类药物，主要是通过抑制促进破骨细胞的形成、分化成熟及凋亡过程的焦磷酸法尼酯合酶(FPPS)形成来起作用的，进而相对的促进骨形成过程，促进骨矿化。且利塞膦酸钠具有在骨折处蓄积效应。因为事实上，BPs类药物从骨骼中消除的半衰期长达10年[35]。通过观察，停止BPs类药物治疗8年后患者尿液中仍可检测到帕米膦酸纳水平[36]。故在本实验检测的BMD结果中，我们不难发现BMD的变化趋势存在一定程度上的时间依赖性，即随着时间的进展增加速度增快。

在本实验结果中，骨折处BMD明显升高情况下，骨痂的生物力学存在如下特性：在短期使用利塞膦酸钠情况下，最大载荷和最大载荷恢复率明显升高，且在一定程度上存在时间依赖性。3组大鼠在组间或组内对比中，骨痂的最大载荷、最大载荷恢复率均随时间的延长逐渐减少，但在B组中各时间点的最大载荷均高于同期C组，且差异有统计学意义，说明可能在髓内钉固定和使用利塞膦酸钠后，骨折断端存在的微动和利塞膦酸钠均能促进骨痂的矿化，使得最初在骨折端形成的体积较大的纤维骨痂向骨性骨痂转化，骨重塑阶段最先开始，骨痂的体积逐渐变小，力学性能也不断提高。而且一定程度的力学刺激也可以促使骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化。在矿化骨痂形成以后，新生骨痂即进入重塑阶段。在这个阶段，主要是机械应力的变化影响骨的形成。而且Sigurdsen等学者[37]在观察大鼠胫骨骨折模型过程中，发现轴向压缩与轴向拉伸相比，其更能促进骨的矿化程度、机械强度及刚度上升。

本研究仅观察了OPF后6周内使用利塞膦酸钠对于骨折愈合情况的影响，所研究时间跨度不长。目前临床上对于OPF患者是否短期内应用BPs类药物促进骨折愈合仍不明确，这也是本实验探究OPF患者短期内应用利塞膦酸钠的必要性。本实验需进一步扩大实验的研究时间跨度，进一步了解时间因素对于骨折愈合情况的影响。且本实验在探究BPs类药物的用药剂量、用药频率、用药方式等方面存在局限性，这几方面也是可能影响骨折愈合的危险因素。本实验中，样本量较小，其结果的稳定性可能不足，同时还应该对于骨痂进行病理切片，进一步了解骨痂的组织构成及成分。