HMGB1 基因多态性与肺结核易感性的关系

袁乐永 柯尊琼

1湖北医药学院基础医学院免疫教研室（湖北十堰442000）；2十堰市人民医院药学部（湖北医药学院附属人民医院药学部）（湖北十堰442000）；3十堰市中西医结合医院（湖北十堰442000）

据WHO 报道［1］，2017年我国结核病年发病人数约为160 万，位居全球第二位，其中死亡病例近5 万。大多数结核分枝杆菌感染呈现潜伏结核感染状态，仅约10%患者会发展为活动性结核病，以上提示机体遗传因素与结核病易感性相关［2］。目前有大量研究［3-8］报道，天然抗性相关巨噬蛋白1（NRAMP1），维生素D 受体，细胞因子，TOLL 样受体（TLR），P2X7 受体，非整合素分子（DC-SIGN）等基因多态性与结核病易感性有关。上述基因大多数参与了人体对结核感染的免疫相关作用。

高迁移率族蛋白1（high mobility group protein，HMGB1）作为一种高度保守的核蛋白，它参与了机体多种病理生理过程。比如，HMGB1 可通过活化巨噬细胞释放炎症因子从而引起机体炎症反应，也与机体免疫相关等［9-10］。目前国内外报道［11-13］了关于HMGB1 基因多态性与多种疾病的关联性研究，比如肺癌、高血压、代谢综合征等。但目前关于HMGB1 基因多态性与肺结核的关系尚未见相关报道。本研究拟采用病例对照关联研究，通过一代测序方法检测肺结核患者外周血HMGB1 基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs），以探讨HMGB1 基因多态性与肺结核易感性的相关性。

1 对象与方法

1.1 对象按照国家统一诊断标准［14］选取2018年1月至2019年1月就诊于十堰市疾病预防控制中心278 例新发结核患者为研究对象，其中男188 例，女90 例，平均年龄（47.2 ± 21.8）岁，排除标准：肺炎、肺癌或其他非结核性肺部疾患等类似病症患者，乙型肝炎、免疫缺陷病或者采用免疫抑制剂治疗的患者等免疫力低下患者；对照组选自且同一地域门诊健康体检人员225 例，其中男150 例，女75 例，平均年龄（46.3 ± 20.5）岁，排除结核病史、结核病接触史以及BCG 接种史，胸片有异常，PPD 试验阳性等人群。所有受试者均无血缘关系，本研究征得所有受试者同意并签署了书面知情同意书。两组研究对象的性别、年龄比较差异无统计学意义，具有可比性。

1.2 外周血DNA 提取抽血前患者及家属签署知情同意书，填写一般资料调查表，采集所有受试者EDTA 抗凝外周静脉血2 mL，采用DNA 提取试剂盒提取样本基因组DNA 并检测样品浓度及纯度，-80 ℃保存备用。DNA 提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。

1.3 HMGB1 基因SNPs 挑取通过生物信息数据库以及以往报道的文献等资料，本实验最终挑取了HMGB1 基因3 个SNPs（rs1045411、rs2249825 和rs1412125）进行进一步探讨。

1.4 HMGB1 基因多态性检测

1.4.1 HMGB1 基因参考序列根据Genebank 中获得的HMGB1 基因序列设计PCR 扩增引物，引物序列见表1，引物采用Oligo 7.0 软件设计，由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 HMGB1 基因多态性位点与引物设计Tab.1 Polymorphisms of HMGB1 gene and primer design

1.4.2 DNA 扩增反应条件以上述提取的DNA为模板，采用PrimeSTAR Max DNA Polymerase 试剂盒进行核酸扩增，该实验扩增反应总体积为40 μL，其中Premix 20 μL、模板10 μL、上/下游引物1 μL，余下用灭菌水补足，均匀混匀，置于PCR 仪进行扩增反应。本实设定的反应程序为：98 ℃变性10 s，63 ℃退火5 s，72 ℃延伸10 s，总共40 个循环。DNA 扩增试剂盒购自日本TAKARA 公司。

1.4.3 测序配制2%琼脂糖凝胶，将PCR 扩增产物加入凝胶进行电泳，溴乙锭染色，紫外线分析凝胶成像系统下观察电泳结果并拍照。将目标条带切下，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒将PCR 产物进行纯化并采用ABI 3500DX 测序仪进行测序。

1.5 统计学方法Hardy-Weinberg 遗传平衡检验及基因型、等位基因和单体型分布频率采用χ2检验并计算比值比（odds ratio，OR）和95%置信区间（confidence intervals，CI），P＞0.05 表示采样符合Hardy-Weinberg 遗传平衡。各SNPs 标记之间采用D'和R（相关系数）进行连锁不平衡分析，D'若R2＞1/3，D'＞0.75 表示显著相关（紧密连锁）。和R（相关系数）表示每对SNPs 之间的连锁不平衡程度。（即单体型频率实际观察值和预测值之间的差异，连锁不平衡的相对大小，值从-1到1）不同等位重组载体的构建各紧密连锁的SNPs 组成的单体型。以上数据分析采用SPSS 17.0 及SHEsis 在线统计软件进行分析，P ＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HMGB1 基因测序结果PCR 产物电泳后经纯化后进行测序分析。本研究检测到HMGB1 基因3 个SNPs 所有基因型，见图1。

2.2 Hardy-Weinberg 遗传平衡检验本研究共纳入研究对象503 例，Hardy-Weinberg 遗传平衡检验结果显示rs1045411、rs2249825 和rs1412125 位点均符合Hardy-Weinberg 遗传平衡（P ＞0.05），说明纳入的研究具有群体代表性。见表2。

2.3 HMGB1 基因等位基因、基因型与结核病的关系HMGB1 基因rs1045411 等位基因G 和A 在对照组分布频率分别为80.44%和19.56%、在结核组分别为79.32%和20.68%；GG、GA、AA 基因型在对照组分布频率分别为67.11%、26.67%、6.22%，在结核组分别为62.23%、34.17、3.60%，差异均无统计学意义（P ＞0.05）。本实验也发现结核组HMGB1 基因rs2249825 与rs1412125 位点的等位基因和各基因型分布频率与对照组比较，差异均无统计学意义（P ＞0.05），见表3。

图1 HMGB1 基因3 个SNPs 位点的测序图Fig.1 Gene sequencing analysis of three SNPs

表2 HMGB1 基因Hardy-Weinberg 遗传平衡检验Tab.2 Hardy-Weinberg genetic balance test for HMGB1 gene 例

2.4 HMGB1基因各遗传模型与结核病的关系研究结果表明，在各遗传模型下，结核组rs1045411位点各基因型分布频率与对照组比较，差异均无统计学意义（χ2＝3.286、1.292、1.886，均P＞0.05）；rs2249825和rs1412125位点各基因型分布在结核组与对照组之间差异也无统计学意义，见表4。

2.5 SNPs 位点连锁不平衡分析采用连锁不平衡检验方法分析HMGB1 基因各多态性位点的连锁情况。Haploview 4.0 软件分析3 个位点的关联性，rs1045411/rs2249825，rs1045411/rs1412125 和rs2249825/rs1412125 的D′值分别为0.87、1.00 和0.85，r2值分别为0.50、0.70 和0.34，见图2。通过D′与r2值发现3 个多态性位点紧密连锁。

2.6 单体型与结核病的关联分析由于分析单体型与疾病之间的关系比单个SNP 位点分析更有意义，因此通过网址分析了4 个不同的单体型与结核病的关系（见表5）。结果发现ACC 单体型与结核病发生风险增加存在强关联（P ＜0.01）；而其他单体型与结核病无明显关联性（P ＞0.05）。

3 讨论

据世界卫生组织报道［1］，全球约1/3 的人口感染过结核分枝杆菌，但仅1/10 的感染者会进一步发展为结核病，以上提示个体差异可能与结核病易感性有关。近年来国内外也报道［3-8］了一些基因多态性与结核病易感性有关，比如NRAMP1、维生素D 受体、白介素和Toll 样受体等基因。HMGB1作为一种晚期炎症介质之一，它通过活化机体巨噬细胞、淋巴细胞等免疫细胞而发挥促炎作用［9］。同时，HMGB1 可上调IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子α 等促炎因子的表达。人体感染结核杆菌后，结核杆菌可激活机体免疫细胞如巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞等发挥免疫应答功能。机体对结核杆菌菌体成分及代谢产物的产生免疫损伤反应，这些免疫细胞发生损伤或坏死，进而产生大量的HMGB1［15］，HMGB1 可进一步加重机体炎症反应，从而引起机体损伤。HMGB1 基因多态性可能会影响其表达，进而加重或减轻机体炎症反应，但结核病易感性与HMGB1 基因多态性关系尚未见报道。

表3 HMGB1 基因rs1045411、rs2249825 和rs1412125 位点多态性分析Tab.3 Polymorphisms analysis of rs1049269，rs1245560，rs1245561 and rs1245562 for HMGB1 gene 例

表4 不同遗传模型下SNP 位点分析Tab.4 Analysis of SNP loci under different genetic models 例

本研究探讨了HMGB1 基因rs1045411、rs2249825 和rs1412125 三个位点与肺结核易感性的关系。研究结果显示，HMGB1 基因rs1045411、rs2249825 和rs1412125 SNPs 位点的等位基因和各基因型分布频率与对照组比较，差异均无统计学意义（P ＞0.05），而结核组rs1045411、rs2249825 和rs1412125 组成的单体型ACC 的分布频率与对照组比较，差异具有统计学意义（P ＜0.05），且可能与结核病易感性有关（P ＜0.01）。以上结果提示单体型ACC 可能会增加HMGB1 蛋白表达水平，HMGB1 水平增加会诱导巨噬细胞和淋巴细胞等免疫细胞释放大量炎症因子，从而促进结核病的进展。

表5 HMGB1 基因单体型分析Tab.5 Haplotype analysis for HMGB1 gene

图2 IRGM SNPs 位点间的连锁不平衡分析图（D′和r2值）Fig.2 Analysis diagram of linkage disequilibrium between IRGM SNPs sites（D′and r2 values）

综上所述，检测HMGB1 基因SNPs 位点对于筛选结核病易感人群有一定临床价值，对于携带上述结核易感基因的结核患者进行早期预防以及早期诊断和治疗具有重要的意义。本次实验虽然在湖北人群中揭示了HMGB1 基因多态性与结核病易感性关系，但该基因的多态性可能与结核病发病风险之间存在遗传异质性，不同的国家、不同的种族、同一国家不同地区、甚至同一地区不同环境HMGB1 基因多态性分布类型可能不同，因此本地区HMGB1 基因的多态性与结核的易感性相关尚不能断定该基因是结核的易感基因。有待于进一步研究和探索。