丙戊酸对乳腺癌MCF7细胞的放射增敏性依赖于抑癌基因p53

田竹筠，杨春旺，蔡祖超，凤志慧

（1.山东大学公共卫生学院，山东济南250012；2.济南市第三人民医院，山东济南250132）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。据世界卫生组织统计，我国乳腺癌发病率和死亡率虽均低于世界平均水平，但近年来乳腺癌的发病率呈迅速增长趋势，因此，如何有效治疗乳腺癌备受关注。电离辐射（ionizing radiation，IR），即放射治疗是临床上常用的乳腺癌治疗手段，寻找有效地增强放射治疗效果的增敏剂是该领域研究的焦点问题。IR 能导致严重的DNA 损伤，即诱发DNA 双链断裂。在DNA 双链断裂修复机制中，同源重组（homologous recombination，HR）修复发挥了重要作用。乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）能调控细胞周期中DNA修复和检查点激活，使该基因与HR修复机制紧密相关[1-3]。重组酶51（recombinase 51，Rad51）是HR 修复机制的关键蛋白，在参与DNA 双链断裂损伤的HR修复中发挥重要作用。丙戊酸（valproic acid，VPA）是一种短链脂肪酸，具有抗肿瘤活性[4]，本课题组和其他研究小组均发现，VPA在治疗癫痫病的血药剂量（0.3～0.8 mmol·L-1）条件下能够抑制肿瘤细胞的生长并具有放射增敏作用[2，5-7]。本课题组研究还发现，VPA 0.5 mmol·L-1可通过干扰BRCA1-Rad51介导的HR 修复机制，增加乳腺癌细胞的放射敏感性[2]。各种不同类型的癌症中约50%会发现抑癌基因野生型p53（wild-type p53，wtp53）存在基因变异。p53在细胞凋亡、细胞周期调控、基因组的稳定性、肿瘤发生和DNA损伤修复等一系列的细胞活动中均发挥重要作用。本课题组研究表明，抑癌基因p53 具有抑制HR修复过度增强的作用，以维持HR功能处于正常水平[8]。在结直肠癌细胞中，p53通过干扰细胞凋亡机制影响VPA的放射增敏作用，表现为VPA的放射增敏作用在wtp53细胞中尤为显著；而对于p53缺欠（defective p53，dp53）的细胞，其放射增敏作用受到抑制[9]。本研究旨在探讨在人乳腺癌MCF7细胞中，对于dp53细胞，VPA 的放射增敏作用是否受影响及其作用机制与HR修复功能之间的关系，为VPA用于临床治疗乳腺癌提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器

人乳腺癌细胞MCF7（美国ATCC公司）。VPA、PLKO1、p53 shRNA慢病毒颗粒和甲紫（结晶紫）（美国Sigma公司）；pDR-GFP质粒（Maria Jasin，Memorial Sloan Kattering Cancer 馈赠）；彗星实验试剂盒（美国Invitrogen 公司）；DAPI 染液（美国Gene Copoeia 公司）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（美国Thermo Fisher公司）；小鼠抗兔P53、β肌动蛋白和磷酸化组蛋白（phosphorylated histone，γH2AX）抗体（一抗）（美国Millipore公司）；小鼠抗兔BRCA1抗体和兔抗小鼠Rad51 抗体（一抗）（美国Santa Cruz 公司）；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L）抗体（二抗）（美国Thermo Fisher 公司）；ALexarFlour488荧光标记鸡抗兔IgG抗体和ALexarFlour594 荧光标记山羊抗小鼠IgG 抗体（二抗）（美国Molecular Probe 公司）。Primus S型医用直线加速器（德国西门子公司）；IX70型倒置荧光显微镜（日本Olympus 公司）；FACS AriaⅢ型流式细胞仪（美国碧迪医疗公司）；5430R Eppendorf 离心机（美国Eppendorf公司）。

1.2 细胞系的建立

用含PLKO.1 或p53 shRNA 慢病毒颗粒液感染MCF7 细胞，建立p53 表达下调的同源配对MCF7 细 胞（MCF7/wtp53 和MCF7/dp53）[8]；向MCF7 细胞中转染pDR-GFP，筛选稳定表达pDRGFP 的MCF7/pDR-GFP 细 胞；用 含PLKO.1 或p53 shRNA 慢病毒颗粒液分别感染MCF7/pDRGFP 细胞，建立MCF7/pDR-GFP/wtp53 和MCF7/pDR-GFP/dp53细胞[7，9]。

1.3 Western印迹法检测P53蛋白表达

取生长状态良好的MCF7 细胞、MCF7/wtp53和MCF7/dp53细胞，按照每皿细胞总数3×106接种于p100培养皿中。培养24 h，消化离心后，提取细胞内总蛋白，按BCA试剂盒操作要求测定蛋白质浓度，将样品蛋白质浓度调配一致，取总蛋白60 μg上样，按照常规处理方法进行电泳[2]。经电泳分离后转印至PVDF 膜上，6%脱脂奶粉封闭1 h，加入抗P53（1∶300）或β肌动蛋白（1∶1000）抗体后置摇床4 ℃孵育过夜，TBST 清洗3 次；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG 二抗室温孵育1 h，加ECL 发光液暗室显影，扫描分析蛋白条带积分吸光度（integrated absorbance，IA），以P53 蛋白与β 肌动蛋白IA比值表示P53蛋白表达水平。

1.4 中性彗星实验检测DNA双链断裂损伤

取生长状态良好的MCF7/wtp53 和MCF7/dp53细胞，制成单细胞悬液，按照每皿细胞总数2×105接种于不同p35培养皿，MCF7/wtp53和MCF7/dp53 细胞各分为4 组：细胞对照组、VPA 组（VPA 0.5 mmol·L-1处理24 h）、IR组（IR 8 Gy）和VPA+IR组（VPA 0.5 mmol·L-1预处理24 h后，IR 8 Gy）。IR处理后恢复30 min，按照常规处理方法进行中性彗星实验[10]，Cometscore 软件分析细胞核拖尾情况。细胞核拖尾尾距越长，表明DNA双链断裂损伤越严重。双链断裂损伤程度（%）=彗星拖尾长度/细胞对照组彗星拖尾长度值×100%。

1.5 免疫荧光实验检测DNA 损伤标志物γH2AX、HR修复蛋白Rad51和BRCA1的焦点形成

取生长状态良好MCF7/wtp53 和MCF7/dp53细胞，按照每孔细胞总数2×104个接种于8 孔载玻片小室内，分组和处理同1.4。IR 处理结束后恢复6 h，按常规方法进行免疫荧光实验[11]。通过倒置荧光显微镜观察细胞内γH2AX，BRCA1和Rad51蛋白焦点形成，计数1000 个细胞中含蛋白焦点阳性细胞数。蛋白焦点形成判定：细胞核内形成明亮而致密的点状结构即为焦点，每个细胞中含有大而明亮的焦点数目＞10，则可计为1个含γH2AX，BRCA1或Rad51蛋白焦点的阳性细胞。

1.6 细胞克隆形成实验检测细胞存活

取生长状态良好的MCF7/wtp53 和MCF7/dp53细胞，按每皿接种细胞总数4×103，接种于p60培养皿，将2 种细胞各分为8 组：细胞对照组、VPA组（VPA 0.5 mmol·L-1处理24 h）、IR（IR 2，4和6 Gy）组及VPA+IR（IR 2，4 和6 Gy）组，每组3 个平行样。处理结束后立即更换新鲜的细胞培养液，按常规方法进行细胞克隆形成实验[12]。继续培养2 周后，肉眼可见细胞克隆形成则终止培养。浓度0.1%的甲紫工作液染色后，计数各组细胞克隆形成数目和细胞克隆形成率。克隆形成率（%）=克隆形成数/接种细胞数×100%。

1.7 流式细胞术检测同源重组修复效率

取生长状态良好的MCF7/pDR-GFP/wtp53 和MCF7/pDR-GFP/dp53 细胞，按每皿细胞总数（2～3）×105分别接种于p60细胞培养皿。2种细胞各分为2 组：细胞对照组和VPA 组（VPA 0.5 mmol·L-1处理24 h），VPA 处理前转入核酸内切酶I-sceI，药物处理结束后更换新鲜的细胞培养液；培养72 h后胰酶消化，117×g离心5 min后弃上清，PBS重悬，通过滤网过滤至流式细胞仪检测管，用流式细胞仪检测1×105个细胞，统计绿色荧光阳性的细胞数。HR修复效率（%）=绿色荧光阳性细胞数/100 000×100%。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 P53表达下调的同源配对细胞模型的鉴定

Western 印迹实验结果显示，与MCF7 细胞相比，含PLKO.1病毒颗粒液感染MCF7细胞后，P53蛋白表达水平未变化；含p53 shRNA病毒颗粒液感染MCF7细胞后，P53蛋白表达水平显著降低（图1），提示成功培育p53 表达下调的同源配对细胞MCF7/wtp53和MCF7/dp53细胞。

2.2 VPA 对lR 所 致MCF7/wtp53 和MCF7/dp53细胞DNA双链断裂损伤的影响

Fig.1 Expression level of protein P53 in human breast cancer MCF7，MCF7/wild type p53（wtp53）and MCF7/defective p53（dp53）cells. B was the semiquantiative result of A. IA：integrated absorbance. s，n=3. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with MCF7 cell group.

彗星实验结果（图2A）显示，①MCF7/wtp53细胞：与细胞对照组相比，IR 组细胞核拖尾尾距增加1.4 倍（P＜0.05），表明IR 能够诱导MCF7 细胞产生严重的DNA 双链断裂损伤；与IR 组相比，VPA+IR 组细胞核拖尾尾距增加1.8 倍（P＜0.05），说明VPA能增加IR诱导的MCF7细胞DNA双链断裂损伤。②MCF7/dp53细胞：与细胞对照组相比，IR组细胞核拖尾尾距增加1.3倍（P＜0.05），表明IR仍可诱导DNA 双链断裂损伤；与IR 组相比，VPA+IR 组细胞核拖尾尾距虽增加1.2 倍（P＜0.05），但与MCF7/wtp53 细胞VPA+IR 组相比降低76.4%（P＜0.05），表明VPA增强IR诱导DNA双链断裂损伤的能力被抑制。由此提示，在MCF7/wtp53 细胞中，VPA 具有增强IR 诱导DNA 双链断裂损伤的作用；抑制p53表达后，VPA对IR的增强作用受到抑制。

免疫荧光结果（图2B）显示，①MCF7/wtp53细胞：与细胞对照组相比，IR组含γH2AX焦点细胞百分率升高39.1%（P＜0.05），表明IR 可诱导严重的DNA 双链断裂损伤；与IR 组相比，VPA+IR 组含γH2AX 焦点细胞百分率升高20.5%（P＜0.05），表明VPA能进一步增强IR所致的乳腺癌细胞DNA双链断裂损伤。②MCF7/dp53 细胞：与细胞对照组相比，IR 组含γH2AX 焦点细胞百分率升高16.7%（P＜0.05）；与IR组相比，VPA+IR 组含γH2AX焦点细胞百分率虽升高16.3%（P＜0.05），但相较于MCF7/wtp53 细胞VPA+IR 组仍降低30.0%（P＜0.05），表明VPA 增强IR 诱导双链断裂损伤的能力受到抑制。由此提示，在MCF7/wtp53 细胞中，IR可诱导严重的DNA 双链断裂损伤，且VPA 能增强IR 诱导的DNA 双链断裂损伤；抑制p53 表达后，VPA增强IR诱导DNA 双链断裂损伤的能力受到抑制，与彗星实验结果相一致。

2.3 VPA 对lR 所 致MCF7/wtp53 和MCF7/dp53细胞存活的影响

Fig.2 Effect of valproic acid（VPA）on ionizing radiation（lR）-induced DNA double strand breaks（DSB）damage in MCF7/wtp53 and MCF7/dp53 cells. VPA group：VPA 0.5 mmol·L-1 treatment for 24 h；IR group：IR 8 Gy；VPA+IR group：VPA 0.5 mmol·L-1 pretreatment for 24 h，then IR 8 Gy. A：comet tail of the DNA damage A1 and comparison of comet tail length（A2）；B：expression of γH2AX focus formation，DNA DSB（B1）and percentage of cells containing γH2AX focus formation（B2）. s，n=3. ＊P＜0.05，compared with corresponding cell control group；#P＜0.05，compared with corresponding IR group；△P＜0.05，compared with VPA+IR group in MCF7/wtp53 cells.

细胞克隆形成实验结果（图3A和B）显示，未给予IR 处理时，①MCF7/wtp53 细胞：与细胞对照组相比，VPA 组克隆形成率降低23.0%（P＜0.05）。②MCF7/dp53 细胞：细胞对照组克隆形成率与MCF7/wtp53 细胞的细胞对照组相比升高50.3%（P＜0.05）；与细胞对照组相比，VPA 组克隆形成率降低13.6%（P＜0.05），但与MCF7/wtp53 细胞VPA组相比仍升高59.7%（P＜0.05）。

Fig.3 Effect of VPA on lR induced survival in MCF7/wtp53 and MCF7/dp53 cells. MCF7/wtp53 and MCF7/dp53 cells were divided into 8 groups respectively：cell control group，VPA group（VPA 0.5 mmol·L-1 treatment for 24 h），IR groups（IR 2，4 or 6 Gy）and VPA+IR groups（VPA 0.5 mmol·L-1 pretreatment for 24 h，IR 2，4 or 6 Gy）.A：the clone formation in MCF7/wtp53 and MCF7/dp53 cells；B：the plating efficiency was measured without IR treatment in MCF7/wtp53 and MCF7/dp53 cells；C：the survival fraction was measured in MCF7/wtp53 and MCF7/dp53 cells.，n=3. ＊P＜0.05，compared with cell control group in MCF7/wtp53 cells；#P＜0.05，compared with VPA group in MCF7/dp53 cells.

细胞在IR 处理后，随着IR 剂量的增加，各组细胞克隆形成率均呈逐渐降低趋势（图3A和C）。①MCF7/wtp53 细胞：与IR（2 Gy）组相比，VPA+IR（2 Gy）组克隆形成率降低8.4%（P＜0.05）；与IR（4 Gy）组相比，VPA+IR（4 Gy）组克隆形成率降低20.4%（P＜0.05），表明VPA 能增强IR 杀伤MCF7细胞的能力。②MCF7/dp53细胞：IR（2 Gy）组克隆形成率与MCF7/wtp53 细胞IR（2 Gy）组相比升高5.9%（P＜0.05）；IR（4Gy）组克隆形成率与MCF7/wtp53 细胞IR（4 Gy）组相比升高17.1%（P＜0.05）；IR（6 Gy）组克隆形成率与MCF7/wtp53 细胞IR（6 Gy）组相比升高21.6%（P＜0.05），表明p53被抑制后，细胞对IR呈耐受状态；VPA+IR（2 Gy）组克隆形成率与IR（2 Gy）组相比无明显变化，但相较于MCF7/wtp53 细胞VPA+IR（2 Gy）组仍升高13.2%（P＜0.05）；VPA+IR（4Gy）组克隆形成率与IR（4Gy）组相比降低9.1%（P＜0.05），但相较于MCF7/wtp53 VPA+IR（4 Gy）组仍升高28.4%（P＜0.05）；VPA+IR（6 Gy）组克隆形成率与IR（6 Gy）组相比降低7.7%（P＜0.05），但相较于MCF7/wtp53 细胞VPA+IR（6 Gy）组仍升高13.8%（P＜0.05），表明在MCF7/dp53 细胞中，VPA 增强IR 杀伤细胞的能力受到抑制。结合彗星和免疫荧光实验结果，提示在MCF7/wtp53 细胞中，VPA 能增强IR 诱导的DNA双链断裂损伤以及IR对MCF7细胞的杀伤能力，即VPA 增加MCF7 细胞对IR 的敏感性，表现为VPA明显的放射增敏作用；但抑制p53 表达后，VPA 的放射增敏作用受到抑制。

2.4 VPA在MCF7/wtp53和MCF7/dp53细胞中放射增敏作用的机制

Fig.4 Mechanism of homologous recombination（HR）repair in MCF/wtp53 and MCF7/dp53 cells. A：the effect of VPA 0.5 mmol·L-1 treatment for 24 h on HR efficiency；A1：flow cytometry；A2：HR efficiency. s，n=3. ＊P＜0.05，compared with cell control group in MCF7/pDR-GFP/wtp53 cells；#P＜0.05，compared with VPA group in MCF7/pDR-GFP/dp53 cells. B and C：BRCA1 and Rad51 focus formation；B1 and C1：BRCA1 and Rad51 focus formation；B2 and C2：the percentage of cells containing BRCA1 and Rad51 focus formation.DAPI was used to stain nucleus.See Fig.2 for the cell treatment.x±s，n=3.＊P＜0.05，compared with MCF7/wtp53 cell control group；#P＜0.05，compared with MCF7/wtp53 IR group；△P＜0.05，compared with MCF7/dp53 VPA+IR group.

流式细胞术结果显示（图4A），①MCF7/pDRGFP/wtp53细胞：与细胞对照组相比，VPA组HR修复效率显著降低51.6%（P＜0.05）。②MCF7/pDRGFP/dp53 细胞：细胞对照组与MCF7/pDR-GFP/wtp53细胞的细胞对照组相比，HR效率升高49.0%（P＜0.05）；与细胞对照组相比，VPA 组HR 效率降低20.3%（P＜0.05），但与MCF7/pDR-GFP/wtp53细胞VPA 组相比仍升高80.3%（P＜0.05）。结果提示，抑制p53表达后，HR修复能力增强。

免疫荧光实验结果显示（图4B 和C），①MCF7/wtp53细胞：与细胞对照组相比，IR 组含BRCA1 焦点细胞百分率升高19.4%（P＜0.05），含Rad51焦点细胞百分率升高40.0%（P＜0.05），表明IR 能激活MCF7/wtp53 中BRCA1-Rad51 介导的HR 修复机制；与IR组相比，VPA+IR 组含BRCA1焦点细胞百分率降低15.6%（P＜0.05），含Rad51焦点细胞百分率降低20.4%（P＜0.05），提示IR 激活的BRCA1-Rad51介导HR修复机制被VPA抑制，表现为VPA的放射增敏作用。②MCF7/dp53 细胞：IR 组与MCF7/wtp53 细胞IR 组相比，含BRCA1 焦点细胞百分率升高31.7%（P＜0.05），含Rad51焦点细胞百分率升高27.6%（P＜0.05），表明抑制p53 表达后，IR激活的BRCA1-Rad51介导的HR机制处于过度增强状态；与IR组相比，VPA+IR 组含BRCA1焦点细胞百分率降低5.8%（P＜0.05），含Rad51 焦点细胞百分率降低8.6%（P＜0.05），但与MCF7/wtp53细胞VPA+IR组相比，VPA+IR组含BRCA1焦点细胞百分率升高41.5%（P＜0.05），含Rad51焦点细胞百分率升高39.4%（P＜0.05），表明VPA 抑制IR 激活HR修复机制的能力受到影响，BRCA1-Rad51介导的HR 机制仍处于过度增强的状态，表现为VPA的放射增敏作用受到抑制，细胞呈现放射耐受状态。上述结果提示，抑制p53表达后，BRCA1-Rad51 介导的HR机制的过度增强可能与VPA对细胞放射增敏作用的下调有关。

3 讨论

已有研究表明，VPA 作为抗肿瘤药物，不但有效抑制癌细胞生长，且对多种肿瘤细胞具有放射增敏作用[2，5-7]。本课题组研究还表明，VPA放射增敏作用与DNA 损伤修复机制有关，可通过干扰BRCA1-Rad51 介导的HR 修复机制，增强IR 对乳腺癌细胞的杀伤作用[2]。BRCA1 与Rad51 是HR修复中的关键蛋白，在DNA 双链断裂损伤修复中发挥重要的作用，提示VPA可能是极有应用前景的肿瘤放疗增敏剂，DNA 损伤修复蛋白（BRCA1 与Rad51 等）可能是其作用的靶点。本研究结果揭示，在MCF7/wtp53 细胞中，VPA 能显著抑制其生长，增强MCF7/wtp53细胞对放射的敏感性；但相对于MCF7/wtp53细胞，MCF7/dp53细胞则表现出对放射的耐受，VPA 抑制其生长的能力降低，以及对MCF7/dp53细胞的放射增敏作用也被抑制，进一步提示VPA的放射增敏作用是受p53功能状态的影响。

已有研究报道，p53表达缺欠后，肿瘤对放疗的敏感性受到抑制，表现出对放射治疗的耐受性[13-14]，且该机制目前还不完全清楚。本研究发现，在无应激刺激时，p53 的表达缺欠导致BRCA1 和Rad51 活性增强，这与本课题组已往研究结果一致，是由于p53 表达缺欠导致的自发同源重组修复效率增强，表现为BRCA1和Rad51活性增强，这种增强作用可能与细胞复制阻滞有关[8]。本课题组已有研究表明，在HR修复过程中存在p53抑制HR和BRCA1 促进HR 两种截然不同的机制，维持2 种机制处于平衡状态对于保证正常的HR修复功能具有重要意义，如果破坏这种平衡状态将会影响肿瘤细胞对放射的敏感性[8]。当p53 表达缺欠时，出现BRCA1和Rad51活性过度增强，HR修复能力也随之过度增强，细胞呈现出对放射的耐受[8]。本研究结果提示，细胞在无IR 处理条件下，p53 缺欠就可引起MCF7/dp53 细胞增殖能力增强，此时VPA 抑制其生长的作用也显著下降，其机制可能与BRCA1 和Rad51 活性以及HR 修复能力增强有关[8]。如用IR处理后，MCF7/dp53细胞对放射的敏感性显著下降，此时VPA对其放射增敏作用也被显著下调，MCF7/dp53 细胞呈现放射耐受状态，其原因是在应激状态下，MCF7/dp53细胞仍然显示出过强的BRCA1 和Rad51 活性与HR 修复能力，也提示p53依赖的VPA所致MCF7/dp53细胞放射耐受作用与细胞的DNA损伤修复能力有关。

有研究表明，p53 基因突变见于＞50%肿瘤患者，而且p53 的表达状态对肿瘤放疗的疗效和患者的预后有重要的意义[15]。本研究结果提示，应用VPA 作为乳腺癌的放疗增敏剂治疗肿瘤时还应考虑p53功能状态，这为VPA用于临床治疗乳腺肿瘤提供了理论和实验依据。