急性心肌梗死病人外周血单个核细胞中miR-146a表达及与短期预后的关系探讨

赵 鹏，张彦周2，吴磊明2，李爱琴，索森森

急性心肌梗死作为是冠心病的严重类型，具有较高的致残率、致死率，是导致死亡的主要因素[1]，严重威胁病人生命健康。研究表明，早期诊断及评估病人病情对改善预后具有重要意义[2]。微小RNA(micro RNA，miRNA)作为广泛存在于生物体内高度保守的短链RNA，在机体多项生理过程中发挥重要作用，与多种疾病发生及进展密切相关，且其具有细胞和组织特异性，可稳定存在于血液中而不被降解，已成为多种疾病的诊断指标[3]。miR-146a作为重要的miRNA类型，在调控固有免疫及炎症反应中发挥重要作用[4]，而炎症反应在加速血栓形成引发心肌心肌梗死中发挥重要作用[5]。本研究拟分析急性心肌梗死病人外周血单个核细胞中miR-146a表达，探讨其与该病的相关性及在预后评估中的意义，以期为临床实践提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年2月—2016年8月在河南焦作市人民医院心内科治疗的急性心肌梗死病人155例作为病例组，其中男88例，女67例，年龄41～77(61.58±9.02)岁，纳入标准：①符合国际心脏病学会及世界卫生组织(WHO)制定的关于急性心肌梗死诊断标准；②发病至入院时间在12 h内；③经心电图、心肌酶及冠状动脉造影等检查确诊。排除标准：①肝、肾等重要脏器严重功能障碍者；②合并心功能不全、严重心律失常、心源性休克者；③恶性肿瘤、神经运动系统疾病、血液系统疾病、免疫系统疾病、急慢性炎症者；④近半年接受过手术治疗者以及临床资料不全者。同期在我院体检中心选取健康者60名作为对照组，其中男37名，女23名，年龄40～78(61.02±8.42)岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究通过医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集 收集所有研究对象性别、年龄、身高、体重、吸烟情况、血压、血脂[总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)]等一般资料，计算体质指数(BMI)，记录急性心肌梗死病人抗凝、降脂、降压药物使用情况以及左心室射血分数(LVEF)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)、B型钠尿肽(BNP)等检测结果。

1.2.2 标本采集和处理 急性心肌梗死病人于就诊24 h、对照组于体检当日分别抽取空腹肘静脉血6 mL，置于乙二胶四乙酸抗凝管内，根据人淋巴细胞分离液(购自北京达科生物技术公司)操作说明对单个核细胞进行分离，并统计细胞数。

1.2.3 利用实时荧光定量PCR技术检测单个核细胞中miR-146a表达 取单个核细胞，加入细胞裂解液，按Trizol总RNA提取试剂盒(购自美国Invitrogen公司)说明提取总RNA，使用紫外分光光度计(购自德国Eppendorf公司)检测总RNA纯度，以A260/A280在1.80～2.20为合格，-80 ℃冰箱保存备用。根据逆转录试剂盒(购自德国Qiagen公司)说明将总RNA合成cDNA，反应条件：40 ℃ 50 min，94 ℃ 5 min，4 ℃ 20 min。根据PCR扩增试剂盒(购自德国Qiagen公司)说明对引物序列配比后在实时荧光定量PCR仪(购自美国ABI公司)上扩增。引物序列：miR-146a，上游5′-ATTTTACAGGGCTGGGACAG-3′，下游5′-TCTTCCAAGCTCTTCAGCAG-3′；U6，上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。PCR反应条件：95 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，76 ℃ 30 s，连续循环38次。每个样品设6个平行复孔。用2-△△Ct法计算单个核细胞中miR-146a相对表达量。

1.2.4 病例随访 所有病人顺利出院，且均进行门诊或电话随访12个月，记录主要不良心血管事件(MACE)发生情况，包括急性冠状动脉事件、心律失常、新发心力衰竭或原有心力衰竭加重、心绞痛、心源性休克或死亡等。MACE评估由心内科具有副主任医师职称以上的两位医师完成评定。将病人分为MACE组和非MACE组。

2 结 果

2.1 病例组和对照组一般资料及外周血中miR-146a表达比较 病例组和对照组性别、年龄、BMI、吸烟、收缩压、舒张压、TC、TG、HDL-C和LDL-C差异无统计学意义(P>0.05)，病例组外周血单个核细胞中miR-146a相对表达量高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 病例组和对照组一般资料及外周血中miR-146a表达比较

注：1 mmHg=0.133 kPa

2.2 外周血中miR-146a表达在诊断急性心肌梗死时的价值 ROC曲线分析结果显示，外周血单个核细胞中miR-146a相对表达量在诊断急性心肌梗死时，曲线下面积0.964(95%CI0.942～0.986)，当miR-146a相对表达量取界值1.65时，灵敏度为91.6%，特异度为91.7%。详见图1。

2.3 MACE组和非MACE组一般资料和外周血中miR-146a表达 随访12个月时，病例组发生MACE46例(29.68%)。两组病人在性别、年龄、BMI、吸烟比例、TC、TG、HDL-C、LDL-C、阿司匹林使用比例、他汀类使用比例、氯吡格雷使用比例和ACEI/ARB使用比例方面差异无统计学意义(P>0.05)；MACE组糖尿病比例、cTnI、BNP和miR-146a表达量高于非MACE组，而高血压比例、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)/血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂(ARB)使用比例、β受体阻滞剂使用比例、LVEF低于非MACE组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

图1 外周血中miR-146a表达在诊断急性心肌梗死时的ROC曲线

表2 MACE组和非MACE组病人一般资料和外周血中miR-146a表达比较

2.4 急性心肌梗死病人预后影响因素分析 以是否发生MACE为因变量，以单因素分析P<0.10的变量为自变量进行多因素Logistic回归分析，对变量进行调整后，结果显示，cTnI、BNP和miR-146a表达量是影响急性心肌梗死病人预后的独立危险因素(P<0.05)。详见表3。

表3 急性心肌梗死病人预后影响因素的多因素Logistic回归分析

2.5 外周血单个核细胞中miR-146a表达在评估病人预后时的价值 ROC曲线分析结果显示，外周血单个核细胞中miR-146a相对表达量在评估病人预后时，曲线下面积0.873(95%CI0.800～0.946)，当miR-146a相对表达量取界值1.83时，灵敏度为76.1%，特异度为90.8%。详见图2。

图2 外周血单个核细胞中miR-146a表达在评估病人预后时的ROC曲线

3 讨 论

急性心肌梗死作为临床上常见的危重症，起病急、进展快、症状重、致死率高[6]。研究表明，急性心肌梗死治疗的关键在于尽早恢复血流重建，心肌缺血时间>12 h，则会出现不可逆性损伤而增加病人死亡风险[7]。但由于部分病人早期症状不明显，且约有50%的病人发病后心电图表现无特异性[8]，因此，积极寻找急性心肌梗死早期诊断及病情或预后评估的生物学标志物已成为临床重点。有研究指出，循环miRNA稳定存在于血液中，且某些miRNA可特异性存在于心肌中[9]，为寻找急性心肌梗死诊断生物标志物及发病机制研究提供了新方向和思路。有研究指出，冠心病病人血浆miR-126表达异常，急性心肌梗死病人中表达下降，可能是病人诊断的新型标志物[10]。miR-146a作为与自身免疫功能及炎症反应密切相关的miRNA，在自身免疫性疾病和炎症反应相关疾病发生及进展中发挥重要作用[11]，研究表明，miR-146a可能通过调控炎症反应而与动脉粥样硬化斑块稳定性关系密切[12]。本研究结果显示，急性心肌梗死病人外周血单个核细胞中miR-146a相对表达量高于对照组，而其他临床指标则与对照组比较差异无统计学意义，说明miR-146a在急性心肌梗死病人外周血单个核细胞中呈高表达，可能参与了急性心肌梗死发病过程。ROC曲线分析结果显示，外周血单个核细胞中miR-146a相对表达量对急性心肌梗死诊断的最佳界值为1.65时，曲线下面积0.964，灵敏度91.6%，特异度91.7%，说明miR-146a对急性心肌梗死具有一定的诊断价值，当外周血单个核细胞中miR-146a相对表达量高于1.65时应考虑急性心肌梗死的可能。

本研究对急性心肌梗死病人随访12个月，发现46例发生了MACE，发生率29.68%，与以往研究报道结果[13-14]无差异。cTnI是目前临床上常用的早期诊断急性心肌梗死的“金标准”[15]，BNP是近年来研究热点，可作为急性心肌梗死诊断及预后评判的指标[16]，本研究在发现，MACE病人外周血单个核细胞中miR-146a呈高表达，且血清cTnI和BNP高于非MACE组，说明miR-146a低表达可能与MACE发生有关。多因素Logistic回归分析结果显示，cTnI、BNP和miR-146a表达量是影响急性心肌梗死病人预后的独立危险因素，说明miR-146a低表达是急性心肌梗死病人预后不佳的独立危险因素，ROC曲线分析进一步发现，外周血单个核细胞中miR-146a相对表达量取界值1.83时，在评估病人预后时，曲线下面积0.873，灵敏度76.1%，特异度90.8%，说明miR-146a表达对急性心肌梗死病人预后具有一定预测价值，可作为评估病人预后的指标。

综上所述，急性心肌梗死病人外周血单个核细胞中miR-146a呈高表达，且与病人不良预后有关，有望成为急性心肌梗死病人诊断及预后评估的潜在标志物。