血清miR-1联合cTn I、TNF-α对病毒性心肌炎诊断及预后评估的价值分析

霍明艳，张 娜，胡 娜，孙 立，王 虹

（承德医学院附属医院心脏内科，河北 承德067000）

病毒性心肌炎以心肌出现局限性或弥漫性炎症反应为特征，侵袭力强，可诱发心肌损伤甚至导致患者出现严重心律失常、心力衰竭或猝死［1］。病毒性心肌炎患者在感染早期症状多不明显，当心肌细胞出现受损时可见心肌损伤标志物出现波动。然而，常用心肌损伤标志物半衰期较短，水平波动快，峰值出现时间不一等问题。目前，病毒性心肌炎的确诊依靠心肌活检，但该检查为侵入式，具有创伤性。理想的生物学标志物可在疾病鉴别诊断和预后评估中发挥重要作用，一直是研究的热点。近年发现，微小核糖核酸-1（microRNA-1，miR-1）与心肌损伤相关疾病如心肌梗死、心衰和心肌炎等的进展关系密切［2-3］。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是重要的炎症因子，前期动物模型证实TNF-α在病毒性心肌炎中可以异常表达［4］。本研究拟通过联合血清miR-1、TNF-α和肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTn I）三项分析对病毒性心肌炎诊断及预后的价值。

材料和方法

1 研究对象纳入

依据我国制定的成人病毒性心肌炎诊断标准［5］，收集2011年9月至2013年8月我院病毒性心肌炎患者86例，其中男性65例，女性21例；年龄范围25～53岁，平均年龄36.3±3.6岁。收取心肌梗死患者80例，其中男性58例，女性22例；年龄范围29～56岁，平均年龄39.2±4.0岁。同期收取健康对照100例，其中男性73例，女性27例；年龄范围26～55岁，平均年龄37.7±3.9岁。纳入标准：①年龄在25～60岁间；②意识清楚，语言表达能力正常，能与调查人员进行正常的沟通；③进行研究目的沟通后，研究对象自愿参与本研究；④签署知情同意书。排除标准：①有自身免疫性疾病史者（如类风湿关节炎、皮肌炎、桥本氏甲状腺炎、甲状腺机能亢进等）；②近期有急慢性细菌、病毒等感染者；③已接受手术或免疫治疗者；④基本信息无法采集或精神分裂症患者无法配合者；⑤未签署知情同意书者。项目经医院伦理委员会批准。

2 样本的采集与前处理

使用含促凝剂采血管抽取病毒性心肌炎患者治疗前及健康对照外周静脉血5ml，于1 h内4℃条件下以3000g离心力离心15min，收集上层血清进行相关指标检测。取500μL血清按照RNA提取试剂盒步骤进行总RNA提取，后经反转录试剂盒进行反转录，保存于-80℃中待测。

3 血清miR-1、TNF-α和cTn I检测

应用RT-PCR（美国Bio-Rad公司C1000型）对miR-1进行相对定量。条件为：95℃变性5min；95℃30s，56℃30s，72℃30s，42循环。内参选择甘油醛-3-磷酸脱氢酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）。设计miR-1与GAPDH引物序列为：miR-1上游：5’-ACTCCATGTCATCGACC AGT-3’，下 游：5’-TGCGTAGGCGATGTCT-3’；GAPDH上 游：5’-GGTTCAAATCGAGTCAT-3’，下游：5’-GAGTCCCGGATCATAAGAA-3’。图1可见，miR-1和GAPDH扩增及熔解曲线峰型单一，未见非特异性扩增。采用2-ΔCt法计算各基因的相对表达量。

采用酶联免疫吸附试验检测TNF-α水平，采用化学发光法检测cTn I水平，检测试剂盒分别由美国R＆D Systems公司和上海超研生物科技有限公司提供。

图1 miR-1和GAPDH扩增和熔解曲线

4 随访内容

每隔3个月门诊随访一次，行心电图、超声心动图检查以判定病情转归，共进行60个月的随访。病毒性心肌炎病情转归标准为［5］：①临床痊愈：无症状，各项检查未见异常；②恢复迁延：患者仅有轻度自觉症状、心电图、超声心动图轻度改变；③心律失常：60个月内表现为稳定的心电图异常，如早搏、传导阻滞、窦速等；④扩张型心肌病：发生进展性心功能不全伴全心扩大，以收缩功能不全为主，心电图显示心律失常；⑤患者死亡。

5 统计学处理

应用SPSS 20.0软件分析。计量资料以均值±标准差（）表示，多组间比较用方差分析，两组间比较用t检验。率的比较用卡方检验或Fisher确切概率法。相关性分析用斯皮尔曼检验。ROC曲线计算血清miR-1、TNF-α和cTn I的诊断价值。检验水准 α＝0.05。

结 果

1 三组间临床资料比较

如表1所示，三组间的年龄和性别差异无统计学意义（P＞0.05）。单因素方差分析显示三组间白细胞、嗜酸性粒细胞和超敏C反应蛋白的差异有统计学意思（P＜0.05）。与健康对照相比，病毒性心肌炎和心肌梗死患者白细胞、嗜酸性粒细胞和超敏C反应蛋白显著高于健康对照（P＜0.05），而病毒性心肌炎和心肌梗死患者白细胞、嗜酸性粒细胞和超敏C反应蛋白水平差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 三组间临床资料比较（）

表1 三组间临床资料比较（）

注：与健康对照相比，*P＜0.05

项目 病毒性心肌炎（n＝86） 心肌梗死（n＝80） 健康对照（n＝100） 统计值 P值年龄（岁） 36.32±3.61 39.16±3.95 37.65±3.87 F＝1.428 0.372男性（%） 65（75.58） 58（72.50） 73（73.00） χ2＝0.242 0.886白细胞（109／L） 14.71±2.22* 14.93±2.41* 7.64±1.27 F＝4.809 0.013嗜酸性粒细胞（%） 14.14±1.72* 13.34±1.50* 2.11±0.23 F＝13.763 ＜0.001超敏C反应蛋白（mg／L） 48.23±9.25* 44.13±7.90* 1.92±0.39 F＝48.552 ＜0.001

2 三组间血清miR-1、TNF-α和cTn I水平比较

单因素方差分析显示三组间血清miR-1、TNF-α和cTn I水平差异有统计学意义（P＜0.05）。与健康对照和心肌梗死相比，病毒性心肌炎患者血清miR-1和TNF-α显著增高（P＜0.05），心肌梗死患者血清TNF-α和cTn I显著高于健康对照（P＜0.05），而健康对照和心肌梗死血清miR-1差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 三组间血清miR-1、TNF-α和cTn I水平比较（）

表2 三组间血清miR-1、TNF-α和cTn I水平比较（）

注：与病毒性心肌炎相比，*P＜0.05；与心肌梗死相比，＃P＜0.05

＜0.001 ＜0.001 ＜0.001病毒性心肌炎（n＝86） 31.61±2.12 122.62±7.14 1.41±0.13心肌梗死（n＝80） 15.16±1.67* 82.15±6.15* 1.72±0.18健康对照（n＝100） 14.14±1.33* 57.84±5.22*＃ 0.12±0.02*＃F值 6.265 8.432 4.918 P值组别 miR-1（-log） TNF-α（ng／L） cTn I（μg／L）

3 血清miR-1、TNF-α和cTn I水平与病毒性心肌炎临床转归

60个月随访中，临床痊愈者50人；恢复迁延者17人；心律失常者13人；并发扩张型心肌病者6人；死亡者0人。以miR-1、TNF-α和cTn I的中位数（miR-1：28.86；TNF-α：116.46 ng／L；cTn I：1.32μg／L）分别将患者分为高、低水平组。相比于低miR-1、TNF-α和cTn I水平组，高miR-1、TNF-α和cTn I水平组的临床痊愈率与恢复迁延率均明显降低，而心律失常与扩张型心肌病的发生率均显著增高（P＜0.05）。而高、低miR-1、TNF-α和cTn I组间白细胞、嗜酸性粒细胞和超敏C反应蛋白水平差异均无统计学意义（P＞0.05），见表3。斯皮尔曼相关性分析显示，血清miR-1、TNF-α和cTn I水平与病毒性心肌炎患者临床痊愈、恢复迁延、心律失常和扩张型心肌病发生均具有显著相关性（P＜0.05），而与白细胞、嗜酸性粒细胞和超敏C反应蛋白无相关性（P＞0.05），见表4。

表3 血清miR-1、TNF-α和cTn I水平与临床转归

表4 血清miR-1、TNF-α和cTn I水平与临床转归相关性分析

4 血清miR-1、TNF-α和cTn I对病毒性心肌炎诊断价值分析

ROC曲线分析显示，血清miR-1、TNF-α和cTn I在区分病毒性心肌炎和健康人群的AUC分别为：0.902（95%CI：0.841～0.964，P＜0.001）、0.789（95%CI：0.704～0.875，P＜0.001）和0.685（95%CI：0.594～0.778，P＜0.001），尤登指数最大时对应的灵敏度／特异性分别为：80.2%／98.9%、79.1%／87.4%和68.8%／61.4%；诊断界值分别为：26.78（-log）、88.42 ng／L和0.28μg／L。联合血清miR-1、TNF-α和cTn I在区分病毒性心肌炎和健康人群的AUC为0.932（95%CI：0.879～0.985，P＜0.001），灵敏度90.2%，特异性91.7%，见图2。

图2 血清miR-1、TNF-α和cTn I对病毒性心肌炎诊断价值分析

讨 论

病毒性心肌炎患者预后差异性较大，报道显示，约50%病毒性心肌炎患者可痊愈，而约20%的患者可遗留不同程度的心脏器质性病变［6］。目前，寻找早期无创筛查与预后评估标志物是病毒性心肌炎的研究热点［7］。

cTn I是心肌细胞特异标志物，其在心肌细胞受损早期即可出现升高，并在反映病毒性心肌炎时心肌细胞损伤具有重要价值。张荣欣［8］对52例病毒性心肌炎血清CK-MB、cTnⅠ与CRP进行检测发现，单独应用cTnⅠ对病毒性心肌炎的灵敏度为65.38%，而在联合三项指标时，灵敏度提高至90.38%，提示联合检测可提高阳性检出率。本研究我们发现病毒性心肌炎患者血清cTnⅠ显著增高，单独应用cTnⅠ鉴别诊断病毒性心肌炎的灵敏度／特异性为68.8%／61.4%，和早前国内报道的结果相符［8］，当联合miR-1、TNF-α和cTn I时较单独应用各指标时的灵敏度提高近10%，达到90.2%，提示联合应用上述三项指标对提高诊断灵敏度具有一定价值，但值得注意的是在联合三个指标后，曲线下面积较单独应用miR-1时仅提高了0.02，由于联合检测会使得检测成本增高，对于联合检测仍需综合考虑。近年来，越来越多的证据表明miR-1和心血管疾病如卒中等关系密切［9-10］。研究发现miR-1在缺血性脑卒中病变模型中发挥作用，在缺血性脑卒中小鼠模型中检测到miR-1的水平较健康对照小鼠显著增高，且miR-1的水平与小鼠神经元的死亡呈正相关［9］。进一步的研究证实，miR-1可以通过调节细胞内p53的水平发挥细胞毒性功能，进而增加小鼠对活性氧（reactive oxygen species，ROS）等氧化应激物质的易感性，加速神经细胞死亡［10］。心肌细胞炎症反应是病毒性心肌炎的病理基础，早前小鼠实验发现，上调miR-1水平可抑制小鼠间隙连接蛋白43（connexin-43，Cx43）表达，促进心肌炎症损伤，而早前研究已证实Cx43表达下调可降低细胞炎症反应［11］，这些研究提示，miR-1在病毒性心肌炎时可出现高表达。然而，关于miR-1在病毒性心肌炎诊断及预后评估的研究尚未见报道。除cTnⅠ与miR-1外，TNF-α与病毒性心肌炎的相关性研究也取得了一定进展。TNF-α参与机体炎症反应过程。阮妙华等［12］在对60只病毒性心肌炎小鼠模型的研究发现，与对照组小鼠比，感染组小鼠血清TNF-α及其下游产物基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2和MMP-9水平均显著增高，而MMP家族蛋白是重要的炎症反应因子。研究指出，TNF-α参与病毒性心肌炎的可能机制是诱导心肌细胞表面白细胞分化抗原（cluster of differentiation，CD）-1d表达，从而增加对柯萨奇病毒易感性［13］。

在本研究中，我们首次探究了联合血清miR-1、TNF-α和cTn I三项指标对病毒性心肌炎的诊断与预后评估价值。研究结果表明，联合检测血清病毒性心肌炎可较好地区分病毒性心肌炎患者与健康人群，且三者的水平与病毒性心肌炎患者的临床转归密切相关，高miR-1、TNF-α和cTn I水平提示不良预后。这些研究结果与前期国内外研究相呼应，表明联合检测血清miR-1、TNF-α和cTn I具有一定的推广价值。然而，本研究尚存在研究例数不足、患者来源单一等缺点，有待后期大样本、多中心的队列研究进一步验证。

综上，本次研究发现联合血清miR-1、TNF-α和cTn I在病毒性心肌炎诊断和预后情况评估有着较大应用价值。