血清分离后室温放置24小时内多肽质谱的变化

郭 菲，高 静，，贾兴旺，董 矜，，杨秋亮，田亚平，，王 涌

（1.解放军总医院医学检验中心，北京100853；2.解放军总医院肾病科，肾脏疾病国家重点实验室，北京100853）

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDITOFMS）是目前最常用的质谱技术之一，它具有高灵敏度、高特异性、高通量、易于自动化等特点，被越来越广泛的应用于生命科学领域，是发现新的生物标志物的有效途径之一［1］。质谱技术可以对多种生物样本进行检测，例如血液、尿液、胸腔积液以及经过培养的细菌等，其中以血液样本的临床应用最广泛。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的磁珠分离技术可以去除样本中的高丰度蛋白和其他杂质，具有良好的敏感性和重复性［2］，因此更适合广泛地应用于临床。为了保障实验结果的准确性和可重复性，分析前实验条件的摸索应该开展，一些重要的分析前因素可能会严重影响人体体液代谢组学的研究。在常规的临床诊断中，分析前因素可能占实验室检测错误的60% ～80%［3］，因此建立质谱分析前样本储存条件的标准化尤为重要。本文通过研究分析血清样本室温放置24 h内多肽质谱的变化，从而为确立血清多肽质谱分析临床适用的检测时间提供参考。

材料和方法

1 研究对象

募集6名志愿者（男性2人，女性4人，平均年龄30岁），编号A、B，C，D，E，F。采集静脉血静置15min后3000g离心10min分离血清。根据血清在室温下（25℃）放置的时间分装血清并分组，分离血清后立即分装冻存入-80℃冰箱的为0 h组、放置2 h分装冻存的为2 h组、放置6 h分装冻存的为6 h组、放置10 h分装冻存的为10 h组、放置24 h后分装冻存的为24 h组。将5组样本同时进行血清多肽质谱检测，分析各组血清多肽峰的变化特点。

2 试剂与仪器

血清多肽提取和测定为血清低丰度多肽。主要试剂有多肽提取用的SPE-C磁珠试剂盒（Bioyong，中国），标准品Peptide calibration standard和标准品Protein calibration standardⅠ（Sigma，St.Louis，美国），基质α-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA）（Sigma，St.Louis，美国），100%色谱级乙醇和100%色谱级丙酮（Sigma，St.Louis，美国）。主要耗材包括：96 targets Anchorchip靶（Bruker Dalton，Bremen，德国），排管（Axygen，NY，美 国），移液器（Eppendorf，Hamburg，德国），磁架（Bioyong，中国），eppendorf管（Axygen，美国），枪头（Axygen，美国）。检测仪器为基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）Clin-TOF-Ⅰ（北京毅新博创生物科技有限公司，中国）。血清多肽提取按照试剂盒标准流程操作，血清质谱分析按照布鲁克道尔顿公司提供的标准操作流程进行。

3 统计学处理

应用 BioExplorer软件（Bioyong，中国）和SPSS22.0进行血清多肽峰的差异分析，血清多肽峰的正态性检验采用Aderson Darling Test，以P＞0.05为正态分布，血清差异多肽峰采用非参数分析（KruskalWallis Test），组间的两两比较用One-Way Anova检验，峰强度和出峰数用±s表示，分析随着室温放置时间的改变，血清多肽质谱的变化特点。

结 果

1 5个时间点的出峰概览及正态性分析

以志愿者C为例，随着时间的变化，血清多肽峰图谱相近但也有所不同（图1）。5个组共出峰58个，Aderson Darling Test分析表明，在58个多肽峰中，符合正态分布的多肽峰各组分别为0 h组（48个）、2 h组（46个）、6 h（51个）、10 h组（51个）、24 h组（45个），表明这5组的血清多肽差异较小，且离心分离血清后6 h分装冻存和10 h分装冻存的血清多肽峰变异最小。5组全峰强度为1599499（6 h组）＞158425（10 h组）＞155672（24 h）＞157030（0 h组）＞155683（2 h组）。

图1 不同时间点血清多肽图谱（志愿者C）

2 血清差异多肽峰分析

非参数分析（Kruskal Wallis Test）结果表明，组间共获多肽峰58个，仅有5个多肽峰差异具有统计学意义（P＜0.01），其余均无统计学差异；组间两两比较的One-Way Anova分析显示，组间差异峰最多的0 h和24 h之间，以及6 h和24 h之间也仅有4条差异峰（表1），表明在常温下放置24 h内血清多肽变异不大。但随着时间的推移，组间差异多肽峰强度有3个呈上升趋势，2个呈下降趋势（图2）。

表1 组间差异峰数量

图2 5个时间点的血清差异多肽峰强度变化

3 峰强最大的10个多肽峰分析

在5组峰强度最大的前10个多肽峰中，8个均相同，且峰强差异无统计学意义（P＞0.05），在这些多肽峰中，从10 h开始出现的血清多肽峰4049.9m/z为差异峰（P＜0.01）（见表2）。随着时间的推移，5个多肽峰峰强呈上升趋势，5个呈下降趋势（图3）。

表2 5组峰强度前10位的血清多肽峰

图3 峰强最大的10个多肽峰随时间变化

4 峰强度大于300的多肽峰比较

应用Bioexplorer软件采集每个样本血清多肽峰强度＞300的出峰数和强度，比较出峰情况，考察均一性。结果表明，各组出峰数均值为22.7±1.75（0 h）、24.0±2.61（2 h）、24.7±1.37（6 h）、23.0±2.19（10 h）、24.5±2.67（24 h）（见表3），峰强累积值为132674（6 h）＞131818（24 h）＞130717（10 h）＞128131（0 h）＞125676（2 h）。

表3 峰强大于300的多肽峰数

5 血清室温放置时间应用性评价

根据正态分布多肽峰个数、全峰强度、峰强大于300的多肽峰数、差异峰4049.9m/z的峰强度这4个因素进行因子分析，6 h组获得最高分（见表4）。

表4 5个时间组的得分和排名

讨 论

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDITOFMS）是蛋白组学中常用来发现新的生物标志物的有力工具，可以用来检测和鉴定多肽、蛋白质、多糖、核苷酸、糖蛋白、高聚物以及多种合成聚合物，尤其是在寻找新的肿瘤标志物和细菌鉴定方面取得了许多成果［4-6］。本实验使用磁珠试剂盒，以弱阳性离子交换原理为基础提取血清多肽，可直接用于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的分析。

分析前过程是代谢组学研究能否成功的关键，分析前因素主要有两个：第一，包括患者准备和样本的采集；第二，为实验前样本的储存及分析预处理［7］。有研究显示，将血清长期储存于-80℃以上，或是短期储存于4℃两个小时以内，对其血清蛋白质组的影响很小甚至是没有［8］。由于受采集条件限制，血液采集后可能无法立即进行冻存，采集的血样在储存和转运途中会在一段时间内暴露于室温，因此，分析室温放置时间对样本检测结果的影响尤为重要。本实验中的所有志愿者均为本单位工作人员，由于受检测条件限制，所有样本经过处理后要统一送到专业的公司进行检测，因此将样本暂时放入-80℃冰箱冻存。血清和血浆是动态调节的，它们的成分随着许多不稳定因素而被氧化，聚集或降解从而发生改变［9］，有研究显示，在3 h内离心分离血浆和血清，血浆和血清代谢谱仍然相当稳定［10］。本实验中，血清均为标本采集后15min离心分离，保证了实验结果的可靠性。SHURUBOR等［11］报道了在一个靶向代谢组学研究中，所测试的61种代谢物，至少有47种代谢物即使暴露于室温48 h，测定结果也足够稳定。国内也有研究表明，血清样本在25℃存放24 h可保持稳定［12］。从本研究结果可以看出，随着室温放置时间的变化，血清多肽峰图谱基本相近，58个多肽峰中差异峰仅有5个，且5组峰强度最大的10个多肽峰中有8个是相同的且峰强度无差异，这些都说明血清室温放置24 h之内多肽峰的差异不大。KAMLAGE等［13］的研究指出，不仅是血液处理时间，还有从离心到冰冻时间，从融化样本到上机分析的时间都应保持在最短，本研究结果与KAMLAGE等的研究略有不同，室温放置6 h和10 h的血清多肽峰出峰更稳定，且这5个差异峰随着时间的推移，峰强度会呈递增或递减变化，在对峰强度大于300的多肽峰的研究中，6 h组的多肽峰出峰均值和标准差都是最优的，峰强叠加也仅次于10 h组，这些均说明室温放置6 h左右再进行分装冷冻的血清最适用于质谱的检测，对于寻找疾病新的标志物更易获得阳性结果。得出此结论的原因也许因为本实验研究对象为血清，KAMLAGE等［13-16］的研究对象为血浆。而血清与血浆中代谢物浓度有明显差异，血清中代谢物的可靠性更高［17］。另有研究显示，血液延长在室温放置时间可造成225个代谢物质中20%显著增加，4%显著减少，且氨基酸和核苷酸的变化百分比最高，而脂质非常稳定［18］，这与本研究中多肽峰的强度随室温放置时间部分升高部分降低的趋势一致。

本研究仅观察到0～10000Da的蛋白，未检测到较大的蛋白，因此我们无法验证5000Da以上的肽增加是否来自较大蛋白的降解。本研究的目的是选择最佳的质谱检测时间，择优标准是既不需要匆忙检测又能避免室温放置时间过长而造成的检测误差，所以只观察到24 h。由于缺乏更长时间的观察，我们无法预测在24 h内增加的肽是否会在24 h后继续增加或降解，这些问题将在今后的研究中继续下去。