UHPLC-Q-TOF-MS/MS 法快速鉴定扶元乳膏中化学成分

谢 月, 黄文平, 欧阳 辉, 梁 奇, 曹丽萍, 张子龙, 杨光义

［1.深圳市宝安中医院(集团),广东 深圳518133；2.江西中医药大学,江西 南昌330006；3.创新药物与高效节能降耗制药设备国家重点实验室,江西 南昌330006］

扶元乳膏为深圳市宝安中医院(集团) 的临床经验方,具有补气温阳、祛风散寒止痛之效,临床上主要用于膝关节骨性关节炎［1-2］、预防围经期骨量减少［3-4］及亚健康疲劳症的治疗［5］,疗效确切,由附子、人参、公丁香、肉桂、细辛、皂荚、冰片7 味中药组成。课题组前期对扶元乳膏的提取工艺进行了研究,在此基础上为了明确该制剂化学成分,进一步阐释其药效物质基础及作用机制,本实验运用UHPLC-Q-TOF-MS/MS 法进行定性研究,并初步作了化学成分的药材归属。

1 材料

Nexera X2 LC-30A 超高效液相色谱仪,配置在线脱气机、高压二元泵、自动进样器、柱温箱(日本岛津公司)；Triple-TOF 5600+高分辨质谱仪,配备ESI 离子源、Analyst 1.6 数据处理软件、Peak View 数据处理软件(美国AB Sciex 公司)；HC-3018R 型高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；Millipore-Simplicity 超纯水处理系统(德国默克密理博公司)；KQ-4000B 型超声清洗机(巩义市予华仪器有限责任公司)；AL204 型电子分析天平［梅特勒-托利多仪器(上海) 有限公司］。

人参皂苷Rf(含有量＞98%,批号BCTG-150712)、人参皂苷Rb1(含有量＞98%,批号BCTG-150712)、华北乌头碱(含有量＞98%,批号BCTG-150712)、次乌头碱(含有量＞98%,批号BCTG-150712) 对照品均购于江西中医药大学中药固体制剂制造技术国家工程研究中心。扶元乳膏(深 圳 市 宝 安 区 中 医 院, 批 号 20170530、 20170820、20170929)。乙腈为色谱纯；其余试制均为分析纯；水为超纯水。

2 方法

2.1 分析条件

2.1.1 色谱条件 COSMOSIL C18色谱柱 (2.1 mm×100 mm,1.7 μm)；流动相0.1% 甲酸(A) -乙腈(B),梯度洗脱(0 ～10 min,22%B；2 ～20 min,22%～42%B；20～25 min,42%～50%B；25 ～32 min,50%～75%B；32 ～40 min,75%～80%B；40 ～43 min,80%～22%B；43 ～48 min,22%B)；体积流量0.25 mL/min；柱温40 ℃；进样量2.0 μL。

2.1.2 质谱条件 采用电喷雾电离源(ESI),正负离子模式,质量扫描范围m/z 100～1 200；喷雾电压-4 500 V；雾化气温度600 ℃；气帘气压172.36 kPa；雾化气和辅助气压344.74 kPa；去簇电压(DP)120 V；采用TOF-MS-IDAMS/MS 法采集数据,TOF/MS 一级预扫描和触发的二级扫描TOF/MS/MS 离子累积时间分别为500、200 ms,CE 碰撞能量为40 eV。

2.2 对照品溶液制备 取人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、华北乌头碱、次乌头碱对照品适量,分别加甲醇配制成0.2 mg/mL溶液,即得。

2.3 供试品溶液制备 取扶元乳膏2 g,加30 mL 三氯甲烷搅拌溶解,蒸馏水萃取2 次,每次20 mL,合并水层,蒸干,甲醇溶解并定容至5 mL,0.22 μm 滤微孔滤膜过滤,即得。

3 结果

3.1 化学成分鉴定 ESI-MS 的质谱总离子流图见图1,结合样品中各色谱峰的精确质量数、分子式及碎片峰信息,再分析各单味药已报道的化学成分,推测了可能的结构。图1 中主要色谱峰的保留时间、质谱信息、推测的分子式、化合物及其碎片离子归属等见表1。

图1 各样品ESI-MS 离子流图

3.2 成分分析

3.2.1 皂苷类 峰12 的一级质谱数据表明［M-H］ 母离子m/z 799.474 1,Peakview1.2 软件给出其元素组成(预测分子式C35H76O19), 误差-4； 二级碎片离子峰m/z 637.433 2、475.380 5、323.262 7、221.208 2；根据对照品信息比对可以鉴定峰12 为人参皂苷Rf,见图2。在二级质谱中,峰12 产生的碎片离子主要为m/z 637、475,进一步证明峰12 物质母核结构为人参三醇,易失去2 分子葡萄糖基(-glc)而产生碎片离子［M-H-glc］、 ［M-H-2glc］,同理鉴定了峰6、7、11。峰13 的一级质谱表明［M-H］ 为m/z 1 107.587 8,二级碎片离子峰m/z 945.323 2［M-H-glc］、783.110 2［M-H-2glc］,推测可能为人参皂苷Rb1。根据相关报道［6-8］,同理鉴定了峰5～6。

3.2.2 生物碱类 峰25 主要产生m/z 616.303 4［M+H］离子,二级质谱有584.291 2［M+H-CH3OH］、552.282 1［M+H-CH3OH］、524.272 2［M+H-CH3OH］、492.262 7［M+H-CH3OH］ 的碎片离子,裂解规律见图3；峰5 主要产生m/z 358.321 2［M+H］ 离子,二级质谱有340.141 2［M+H-H2O］、322.315 2［M+H-H2O］ 的碎片离子,两者通过对照品推测,可能分别为次乌头碱、华北乌头碱。根据上述裂解途径,结合相关报道［9-11］,同理鉴定了峰9、17、19、23。

表1 扶元乳膏化学成分分析

图2 人参皂苷Rf 裂解规律

3.2.3 黄酮类 峰16 母离子m/z 299.057 9,二级质谱285.043 3［M-H-CH2］、284.036 9［M-H-CH3］、255.029 3［M-H-CO2］、227.034 8 ［M-H-CO］, 结合相关报道［12］,推测可能为山柰素。根据黄酮的裂解途径,推测峰3 可能为5,7,2′-trihydroxy-3,6,8,4′,5′-pentamethoxyflavone。

3.2.4 香豆素类 峰4 母离子m/z 353.090 8,二级质谱191.055 9 ［M-H-glc］、 173.045 5 ［M-H-glc-H2O］、155.035 3［M-H-glc-2H2O］、135.045 3、111.045 6［M-Hglc-2H2O-CO2］,结合相关报道［13］,推测可能为东莨菪苷。同理根据裂解途径,推测峰10 可能为 (2S,3R,4R,4aS,7R, 8S, 8aS) -8-acetoxy-2, 4, 7, 8a-tetramethyl-6-oxooctahydropyrano ［3, 2-b］ pyran-3-yl (2E, 4S) -4-hydroxy-2-octenoate。

3.2.5 其他 峰1 母离子m/z 387.117 3, 二级质谱341.113 9［M-H-C2H5OH］、179.058 3［M-H-C2H5OH-glc］、161.047 4［M-H-C2H5OH-glc-H2O］、89.026 6,根据Chem-Spider 数据库,推测可能为7-(α-D-glucopyranosyloxy) -2,3,4,5,6-pentahydroxyheptanoic acid。

4 讨论

扶元乳膏主要由附子、人参、皂荚等组成,附子主要含生物碱类,而人参主要含皂苷类,因此采用正负离子模式采集离子流图,发现响应不同,可能因为生物碱类成分正离子响应较负离子强。附子中生物碱类在正离子模式下都有良好的响应,因此选择该模式对其进行研究,可快速有效地鉴别特征化合物。

人参皂苷是人参特有的三萜类成分,在负离子模式下逐一脱糖后可以看到m/z 459、475 的皂苷元特征碎片离子峰。由于人参皂苷中存在多种同分异构体,在质谱中产生相同的离子碎片,如人参皂苷Rg1、Rf、Re,仅通过相对分子质量和碎片离子很难将其区分。今后,可以结合对照品质谱数据进一步加以区分。

UHPLC-Q-TOF-MS/MS 是近年发展起来的液质联用技术,在中药、复方等复杂体系分析上具有独特优势,可在较短时间内完成化学成分的分析鉴定工作,避免粗提、纯化的繁琐过程。本研究首次运用该方法对扶元乳膏化学成分进行鉴定,结合精确相对分子质量、多级质谱信息、相关文献,共确定了包括生物碱类、皂苷类、黄酮类、香豆素类在内的25 个化合物,并可初步快速追踪到中药复方指标成分,如本方中的生物碱(附子) 和人参皂苷Rf(人参),为进一步建立质量控制标准、研究药效物质基础提供可靠依据。

图3 次乌头碱裂解规律