枸杞HPLC 指纹图谱的建立及3 种成分测定

白光灿, 李娅琦, 张泽坤, 郭慧清, 王梓轩, 李 月, 马长华

(北京中医药大学中药学院,北京100102)

枸杞为茄科植物宁夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果实,是我国传统名贵药材,具有调节免疫功能、保肝、抗氧化损伤、抗肿瘤等药理作用［1-3］,一般认为与其所含枸杞多糖、类胡萝卜素和黄酮等活性成分相关［4-6］。早期研究主要针对枸杞多糖和黄酮类,近年来开始关注类胡萝卜素类,并发现其在人体内的多种生物活性,作为VA的来源治疗皮肤角化症、猝灭单线态氧、清除自由基、防止细胞膜损伤、调控机体免疫应答等［7］。目前,枸杞质量标准未对类胡萝卜素类含有量进行限量要求,文献也主要集中在不同成熟度、加工方式枸杞中其含有量变化方面［8-10］,但关于其指纹图谱及不同产地聚类分析的研究较少［11］。本实验从指纹图谱和指标成分含有量测定2 方面同时对枸杞质量进行定性和定量评价,旨在为药材质量的全面评价提供参考依据。

1 材料

1.1 仪器 Thermo Scientific Ultimate 3000 高效液相色谱仪(美国赛默飞公司)；KQ-400KDE 高功率数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；Mettler AE240 电子分析天平(十万分之一,法国施耐德电器有限公司)；Sartorius AG BS电子分析天平(万分之一,法国施耐德电器有限公司)。

1.2 试药与试剂 二氯甲烷、正己烷、乙腈、甲醇(色谱级,美国Fisher 公司)； 石油醚、 丙酮 (色谱纯, 德国Merck 公司)；甲醇、无水乙醇,分析纯(北京化工厂)；娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。对照品玉米黄素(河南省标物生物科技有限公司,批号170417,含有量≥98%)、β-胡萝卜素(河南省标物生物科技有限公司,批号170108,含有量≥98%)、玉米黄素双棕榈酸酯(上海同田生物技术股份有限公司,批号144-67-2,含有量≥98%)。

1.3 药材 收集宁夏、甘肃、新疆、青海和内蒙古5 个产地共35 批枸杞样品,经北京中医药大学刘春生教授鉴定鉴定为茄科植物宁夏枸杞Lyciumbarbarum L.的干燥成熟果实。信息见表1。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相乙腈-甲醇-正己烷-二氯甲烷 (40 ∶15 ∶20 ∶20)； 体积流量1 mL/min； 柱温25 ℃； 检测波长450 nm；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 取玉米黄素、β-胡萝卜素适量,分别精密称定1.04、2.13 mg,加入二氯甲烷溶解后,流动相分别定容于10、100 mL 量瓶中；取玉米黄素双棕榈酸酯适量,精密称定9.21 mg,加入玉米黄素、β-胡萝卜素对照品溶液各1 mL 后,流动相定容于5 mL 量瓶中,即得。玉米黄素、β-胡萝卜素、玉米黄素双棕榈酸酯质量浓度分别为20.80 μg/mL、4.26 μg/mL、1.84 mg/mL。

2.2.2 供试品溶液 提取方法参考陈敏［12］报道并进行调整。称取1 g 枸杞粉末,精密称定,加入0.01%BHT(二丁基羟基甲苯),15 mL 石油醚-丙酮(2 ∶1) 混合溶剂常温提取3 次至残渣无色,每次30 min,合并提取液,转入分液漏斗,蒸馏水洗去水溶性成分,石油醚层用无水硫酸钠干燥,旋转蒸发浓缩至干,石油醚定容至25 mL,微孔滤膜过滤,取续滤液,即得。提取过程避光。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液10 μL,在“2.1” 项色谱条件下连续进样6 次,以1 号峰玉米黄素为参照峰,得各共有峰相对保留时间RSD 0.44%～2.57%,相对峰面积RSD 0.94%～2.84%,表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取同一批次枸杞粉末6 份,制备供试品溶液,精密吸取10 μL,在“2.1” 项色谱条件下进样,以1 号峰玉米黄素为参照峰,各共有峰相对保留时间RSD 1.32%～2.93%,相对峰面积RSD 1.21%～2.85%,表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取同一供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下于0、2、4、8、12、24 h 进样,各共有峰相对保留时间RSD 0.98%～2.59%,相对峰面积RSD 1.41%～2.52%,表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4 指纹图谱建立

2.4.1 相似度评价 选取宁夏、甘肃、青海、新疆每个产地各3 批次枸杞药材的HPLC 图,导入中药指纹图谱相似度评价系统中,选择中位数计算方法,确定最佳时间窗宽度为0.1 min,采用多点校正,经过色谱峰自动匹配,生成对照图谱,进行色谱峰整体相似性评价,见图1,不同产地12 批样品HPLC 色谱图整体峰形一致,相似度0.924 ～0.991,见表2,表明不同产地枸杞化学成分相近,具有较好的均一性。共标定9 个共有峰,保留时间为2.01 min 处的1 号色谱峰响应较高,分离良好,故选作参照峰。

图1 12 批样品HPLC 指纹图谱

2.4.2 聚类分析 采用SPSS 22.0 软件将35 批样品9 个共有峰峰面积作为原始数据进行系统分析,结果见图2,可知主要分为2 大类,其中产地为宁夏、青海的聚为一类,新疆、甘肃、内蒙古的聚为一类,表明青海、宁夏枸杞在化学成分方面具有较高的一致性。

2.5 含有量测定

2.5.1 色谱条件 在“2.1” 项下色谱条件下进样测定,色谱图见图3。

2.5.2 溶液制备 按“2.2” 项下方法制备供试品、对照品溶液。

2.5.3 线性关系考察 取“2.2.1” 项下对照品溶液2、1、0.5、0.25、0.1 mL,定容于5 mL 量瓶中,包括未稀释的混合对照品溶液共6 个不同质量浓度,在“2.1” 项色谱条件下进样。以峰面积为纵坐标(Y),质量浓度为横坐标(X) 进行回归,结果见表3,表明各成分在各自范围内线性关系良好。

图2 35 批样品聚类树状图

图3 各成分HPLC 色谱图

表3 各成分线性关系

2.5.4 精密度试验 精密吸取玉米黄素、β-胡萝卜素、玉米黄素双棕榈酸酯对照品溶液各10 μL,在“2.1” 项色谱条件下连续进样6 次,测得峰面积RSD 0.45%～1.39%,表明仪器精密度良好。

2.5.5 稳定性试验 按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液,于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样,测得各成分峰面积RSD 0.33%～3.84%,表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.5.6 重复性试验 精密称取同一批枸杞6 份, 按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样,测得各成分含有量RSD 1.15%～4.61%,表明该方法重复性良好。

2.5.7 加样回收率试验 精密称取含有量已知的宁夏1 号样品0.5 g,平行6 份,精密加入一定量(近似1 ∶1) 对照品溶液,按 “2.2.2” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样,计算回收率。结果,玉米黄素、β 胡萝卜素、玉米黄素双棕榈酸酯平均加样回收率分别为96.50%、 97.23%、 103.2%, RSD 分 别 为2.71%、2.94%、3.73%。

2.5.8 样品含有量测定 精密称取不同批次枸杞粉末各1 g,平行3 份,按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样,根据标准曲线计算其含有量,结果见表4。

表4 各成分含有量测定结果

3 讨论与结论

3.1 条件选择 枸杞中的类胡萝卜素类成分主要包括类胡萝卜素和类胡萝卜素酯两大部分［12］。本实验首先对甲醇-乙腈(45 ∶55) 流动相体系进行了研究,结果发现甲醇-乙腈体系无法洗脱出枸杞中的类胡萝卜素酯类成分,这可能是由于类胡萝卜酯类成分极性太小的原因。通过向流动相中添加一定比例的正己烷和二氯甲烷,可以有效地洗脱出类胡萝卜素酯类成分。值得注意的是,常规反相高效液相色谱仪的在线脱气装置对正向溶剂的耐受性较差,本实验通过调整流动相流路,使流动相不经过在线脱气装置直接进入泵元件,避免了溶剂对仪器原件的损害。流动相在使用前,需要提前混合均匀并超声脱气。

3.2 结果分析 由于玉米黄素双棕榈酸脂色谱峰占总色谱峰面积的70%以上,给相似度计算带来较大误差,故进行指纹图谱相似度匹配时舍去此峰。不同产地12 批样品HPLC 色谱图的整体峰形一致,相似度0.924～0.991。利用平均数法计算平均图谱,作为HPLC 对照指纹图谱为枸杞类胡萝卜素类成分质量评价的依据。此外,35 批样品的聚类分析表明,宁夏、青海枸杞聚为一类,表明2 个产地枸杞化学成分更为相近,具有较好的均一性。

含有量测定结果表明,不同产地枸杞中含有的化学成分种类差异不大,但本实验测定的3 种成分含有量具有较大差异,最高的为玉米黄素双棕榈酸酯(21.03 mg/mL),以青海德令哈(S23、S18)、宁夏中宁(S8) 较高；其次为玉米黄素(0.141 8 mg/mL),以宁夏中宁(S11)、青海德令哈(S24) 较高；β-胡萝卜素最低(0.010 6 mg/mL),以青海德令哈(S23、S24) 较高,这是由于玉米黄素和β胡萝卜素为玉米黄素双棕榈酸酯的生物合成前体,随着枸杞的生长成熟,枸杞中玉米黄素双棕榈酸酯的含有量逐渐增加,而且是类胡萝卜素积累的主要形式,也是成熟枸杞的特征类胡萝卜素［9］。因此,本实验选择该3 种成分作为枸杞质量评价的指标。

此外,通过测定不同产地枸杞中类胡萝卜素含有量发现,产于宁夏和青海的较高,并且更为接近,表明两地枸杞质量更为相似,与聚类分析结果一致。

综上所述,本研究建立枸杞HPLC 指纹图谱,并测定3种成分的含有量,该方法简便准确,重复性好,可为该药材质量控制提供参考。