袁强华, 呼 梅, 谈 静
(成都中医药大学附属医院,四川 成都610072)
汤剂是中医临床普遍广泛的用药方式[1],但其煎煮耗时长、流程繁杂、质量难控制及参差不齐等缺点影响了患者对中医药的认同感。近年来,随着科技发展和技术进步,也出现了一些新的不同形式中药饮片,如配方颗粒、超微饮片、破壁饮片等[2],在一定程度对传统饮片进行了有的补充,有着积极的临床意义,但也存在明显的问题,如标准不明确、剂量不统一、缺乏临床使用合理性证明等[3],给市场监管带来了困扰。为了解决上述问题,以陈士林为首的研究人员提出了中药饮片标准汤剂的理论,旨在提高临床用药准确性、疗效一致性、用药安全性[4]。
化扁方作为成都中医药大学附属医院临床治疗急性化脓性扁桃体炎、急性咽炎的经验方,由川银花、连翘、黄芩、牛蒡子、竹叶柴胡、薄荷、浙贝母、皂角刺、天花粉、鱼腥草10 种药味组成。本实验在前期绿原酸类(新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C)、黄酮类(黄芩苷)、木脂素类(连翘苷、牛蒡苷) 成分定量分析的基础上[5],对化扁方在5、10、15 倍加水量下不同煎煮时间点上述成分含有量进行检测,绘制含有量/煎煮时间动态分布趋势图,探索影响其煎煮效果的关键工艺参数,再采用正交试验优化,以期为该方标准汤剂制备工艺规范确定及后续相关产品开发提供依据。
1.1 仪器 安捷伦1260 型高效液相色谱仪(配置四元泵、DAD、在线脱气、OpenLAB 工作站,美国安捷伦科技公司);BP211D 电子分析天平(十万分之一,瑞士梅特勒-托利多公司)。
1.2 试药 绿原酸 (批号110753-201313, 含有量96.6%)、咖啡酸(批号110885-200102,含有量100%)、黄芩苷 (批号110715-201318,含有量93.3%)、连翘苷(批号110821-201213, 含有量95.3%)、 牛蒡苷 (批号110819-201007,含有量95.4%) 对照品均购自中国食品药品检定研究院;新绿原酸(批号170809,含有量98.9%)、隐绿原酸 (批号170809,含有量99.2%)、异绿原酸B(批号170102, 含有量98.8%)、 异绿原酸A (批号171010,含有量98.8%)、异绿原酸C(批号170102,含有量99.1%) 对照品均购自成都植标化纯生物技术有限公司。乙腈为色谱纯(美国天地公司);其他试剂均为分析纯;水为超纯水。
2.1 色谱条件 岛津Insertsustain C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相乙腈(A) -0.2%磷酸(B),梯度洗脱(0 ~18 min,10%A;18 ~21 min,10%→23%A;21~50 min,23%A);体积流量1.0 mL/min;柱温35 ℃;检测波长327 nm(0~37 min,新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C)、278 nm(37~41.3 min,黄芩苷)、228 nm(41.3 ~50 min,连翘苷、牛蒡苷);进样量10 μL。
2.2 溶液制备
2.2.1 对照品溶液 精密称取对照品新绿原酸10.21 mg、绿原酸20.45 mg、隐绿原酸10.13 mg、咖啡酸10.33 mg、异绿原酸B 10.15 mg、异绿原酸A 10.33 mg、异绿原酸C 10.27 mg、黄芩苷49.55 mg、连翘苷10.12 mg、牛蒡苷10.23 mg,置于50 mL 棕色量瓶中,甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,各精密吸取2 mL,置于25 mL 量瓶中,甲醇定容至刻度,摇匀,即得,置于4 ℃冰箱中保存。
2.2.2 供试品溶液 精密吸取水煎液2 mL,置于25 mL量瓶中,50%甲醇定容至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
按处方比例称取药材约300 g,置于三口圆底烧瓶中,分别加5、10、15 倍量水浸泡透心,回流提取,分别在沸腾 后 15、 30、 45、 60、 75、 90、 105、 120、 135、 150、165、180 min 各取药液10 mL,同时补加同温介质10 mL,药液过滤,放冷,各精密吸取2 mL 于25 mL 棕色量瓶中,甲醇定容,摇匀,0.45 μm 微孔滤膜过滤,取续滤液作为供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下测定,并绘制含有量-煎煮时间动态分布趋势图,见图1。
图1 各成分含有量-煎煮时间动态分布趋势
由图可知,同一加水量下,绿原酸类、黄酮类、木脂素类成分含有量-煎煮时间趋势一致;不同加水量下,绿原酸类、木脂素类成分含有量依次为5 倍<10 倍<15 倍,黄酮类成分依次为5 倍<15 倍<10 倍;绿原酸类成分含有量在煎煮45 min 后达到平衡,而黄酮类、木脂素类分别在煎煮60、150 min 后;绿原酸类成分含有量在煎煮时间15 ~180 min内均呈下降趋势,而且损失率与加水量一致。
图1 显示,影响煎煮效果的因素为加水量、煎煮时间,故对其进行优化。将提取次数设定为3 次,其中第1、3 次煎煮时间的3 个水平分别为10、15、20 min,第2 次分别为30、40、50 min;加水量3 个水平分别为5、10、15 倍。再采用正交试验,以总绿原酸(包括绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C)、黄芩苷、连翘苷、牛蒡苷含有量及总固形物率的综合评分为评价指标(根据药效成分来源药材在处方中的比例,拟定 其 权 重 系 数 分 别 为 0.176、 0.088、 0.176、 0.088、0.472) 优化煎煮工艺,因素水平见表1。
表1 因素水平
按处方比例称取全部药材约170 g,浸泡30 min 后将药液减压浓缩至1 000 mL,作为供试品药液,取适量测定。结果见表2,方差分析见表3。由表2 可知,各因素影响程度依次为加水量(A) >第2 次煎煮时间(C) >第1 次煎煮时间(B) >第3 次煎煮时间(D),根据综合评分极差显示最优工艺为A3B3C3D3;由表3 可知,除A 因素(P<0.05) 外其他3 个因素无显著影响(P>0.05)。由此确定,最优工艺为A3B1C1D1,即加15 倍量水煎煮3 次,煎煮时间15、30、15 min。
按处方比例称取3 份药材,质量分别为170、510、1 630 g,浸泡30 min,按照优化工艺操作,分别减压浓缩至1 000、3 000、9 000 mL,进行3 批验证试验,结果见表4。由表可知,9 份样品各指标RSD 均小于5%,表明工艺合理可行。
表2 试验设计及结果
表3 方差分析
表4 验证试验结果(n=3)
关于标准汤剂的研究大多针对单味中药,但临床应用中复方汤剂才是主要形式。在传统复方汤剂制备时大多依据主观经验,缺乏对全方整体性考虑,其加水量和煎煮时间不尽合理,导致临床疗效出现偏差,如加水量偏少或煎煮时间过短,药效成分煎出率不足;煎煮时间过长,不耐热药效成分发生降解等[6]。因此,标准汤剂制备既要借鉴传统汤剂,更要对对后者合理性进行探讨,从而得出关键工艺参数(加水量、煎煮时间) 量化值[4]。
图1B 显示,在180 min 内绿原酸含有量随着煎煮时间延长逐渐降低,其原因时该成分为咖啡酸奎尼酸酯,在pH值2.0~3.0 或3.0 ~8.0 时,分别能被酸或碱催化发生水解[7]。不同加水量下化扁汤药液pH 值介于4.3 ~4.8 范围内,符合绿原酸被碱催化发生水解反应的要求,,同时料液比由1 ∶5 升至1 ∶15,其损失率也增大。
图1B、1 J 显示,加水量15 倍时绿原酸含有量在煎煮15 min 后与10 倍基本一致,但在15 ~180 min 范围内的损失率均高于后者;黄芩苷含有量在煎煮15 min 后与10 倍加水量基本一致,但在15~180 min 范围内含有量均低于后者,这与增加溶剂量促进其溶出的预期结果相反,该成分为黄酮类化合物,含游离酚羟基而显酸性,易与碱性物质结合加速溶出[8-10],但加水量15 倍时更多碱性物质参与绿原酸碱催化水解反应,而与其结合量随之减少,影响了溶出,导致其溶出速率下降。
由图1E、1F、1G、1H 可知,180 min 内异绿原酸A、异绿原酸C 含有量随着煎煮时间延长逐渐降低,而异绿原酸B 逐渐增高,三者总含有量在煎煮时间45~180 min 内基本平衡,其原因是它们受温度影响而发生结构转变,体现为前两者转化为后者[11]。