姜黄素提取分离及其体内外分析方法的研究进展

侯雯清, 岑愉萍, 范国荣, 沈报春*, 李 霁*

(1.昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室,云南昆明650500；2.上海市松江市场监管局,上海201600；3.上海交通大学附属第一人民医院,上海200025)

姜黄素是从姜科、天南星科植物根茎中提取出的一种酚类物质,分子式为C21H20O6,长期以来被用作香料和天然着色剂,如今是WHO 和FDA 公认的食品、化妆品的天然添加剂,如抗氧化剂、食用色素等［1］,在中国和印度被用作传统药物使用,具有降血脂、抗肿瘤、抗炎、利胆、抗氧化、抗肝细胞毒性、抗风湿、抑菌等广泛药理作用,而且毒性较低,临床应用潜力良好,已成为国内外研究的热点［2］。

本文对近10 年来有关姜黄素的国内外文献进行归纳,总结评价其提取、分离、体外分析方法,以期为更好地开发利用姜黄这一药食同源的传统中药提供参考。此外,姜黄素生物利用度较低,本文也对近几年其体内分析方法进行比较,为其体内药动学研究及今后相关新药研发提供借鉴,也使其能更安全有效地应用于临床治疗、食品添加剂、美容护肤品等领域。

1 提取、分离制备

1.1 提取 姜黄素主要来源于姜黄根茎,也可从莪术、郁金、生姜中提取,在姜黄中含有量最高,约3%～6%,莪术次之,郁金最低。提取姜黄素的方法一般为有机溶剂提取法、酸碱提取法、酶提取法、超临界CO2流体提取法、水杨酸钠法、闪式提取法等,其中有机溶剂提取法最常用。杨柳等［3］已对中文文献中常用提取方法进行总结,但未涉及外文文献,故本文补充近10 年来外文文献报道的姜黄素提取方法,以及该综述中未曾引用的新方法。

加速溶剂萃取(ASE) 又称快速溶剂萃取,是一种密闭容器内在提高温度(50 ～200 ℃) 和压力(6.89 ～20.7 MPa) 的条件下,用溶剂从固体、半固体基质中提取分析物的新型萃取技术。Yadav［4］采用该方法对乙醇、乙酸乙酯、丙酮作为萃取溶剂的性能进行了比较,发现乙醇(8.4%) 提取率最高,其次为乙酸乙酯(7.4%) 和丙酮(6.6%)；姜黄素纯度以丙酮(46.2%) 提取最好,其次为乙醇(43.4%) 和乙酸乙酯(38.8%)。ASE 技术较常规提取方法,具有省时、消耗溶剂少、提取效率高、操作模式多样化、过程自动化等优点。

D'Archivio 等［5］以响应面法优化乳酸乙酯提取效率,通过增强的单纯形-质心混合物设计来监测提取效率与提取介质(水、乙醇和乳酸乙酯) 中3 种溶剂的比例相关性,发现乳酸乙酯将是一种提取姜黄素类化合物的良好溶剂；Shirsath 等［6］综合比较了溶剂类型、萃取时间、萃取温度、固体与溶剂比例、粒径、超声功率等操作参数对萃取率的影响,发现1 h 内可获得72%提取产率。Kwon［7］采用亚临界溶剂萃取法,通过改变温度(110～150 ℃)、时间(1 ～10 min)、压力(5 ～100 MPa)、固-溶比,从姜黄中提取3种姜黄色素,发现其最大产率为13.58%,该方法更快更有效,有可能开发出用于提取类姜黄素的商业方法。

目前,对于姜黄素的提取已开发出多种技术,发展得也较为成熟。其中,酸碱水提取需在强酸、强碱条件下转换以使目标物析出,使得姜黄素性质不够稳定,并且提取后有大量淀粉存在而影响进一步精制；酶提取是在碱水提取基础上作进一步改进以缩短提取时间,提高提取率,但反应条件及碱度难以控制,不易在生产上推广使用；超临界CO2流体提取溶剂经济无毒,不易参加反应,易于分离,但提取压力、温度、CO2消耗量、夹带剂等因素显著影响萃取率；传统醇提取工艺简单,反应条件易于控制,环境友好,容易在生产中推广应用,但提取时间往往较长,提取效率、收率较低；超声提取可明显提高收率,操作简便易行,但受超声波衰减因素制约,其有效作用区域为一环形,如果提取罐直径太大,在罐周壁就会形成超声空白区,不利于提取完整而影响回收率；加速溶剂萃取法操作简便,耗时短,测定结果偏差小,回收率高,适合在生产中推广使用。由此可知,在提取技术研发中提取溶剂、提取方法联用是发展趋势,开发出一种经济高效的提取方法并应用于工业化生产,将是姜黄素今后开发利用的重要步骤。

1.2 分离制备 经过粗提取所得姜黄素中常含有姜黄脂肪、姜黄树脂等,使其纯度较低,所含杂质也影响后期使用,故必须对粗品作进一步分离纯化。传统分离纯化方法通常为酸碱沉淀法、溶剂萃取法、活性炭吸附柱层析法、硅胶色谱法、聚酰胺吸附法、正丙醇重结晶法、大孔树脂吸附法,近年来高速逆流色谱技术、分子印迹技术快速发展,并应用到姜黄色素的分离纯化中。

Inoue 等［8］采用高速逆流色谱法(HSCCC),以正己烷-氯仿-甲醇-水(5 ∶10 ∶7.5 ∶2.5) 组成的简单两相溶剂系统分离纯化姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素,从25 mg 姜黄粉中可分离得到1.1 mg 姜黄素、0.6 mg 去甲氧基姜黄素、0.9 mg 双去甲氧基姜黄素(含有量＞98%)。该方法最大优点是每次进样量比较大,可达到毫克级,甚至克级,而且是无载体的分离,故不存在载体吸附,样品利用率很高。

分子印迹技术是结合高分子化学、生物化学等学科发展起来的一门边缘学科,是具备特异识别功能的新兴技术,分子印迹聚合物是基于抗原-抗体结合原理制得的具有预定性、稳定性及特异性识别功能的一种新技术材料。Wulandari 等［9］以姜黄素作为模板,N-(2-氨基乙基) 甲基丙烯酰胺(EAMA) 为功能单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA) 为交联剂,乙腈/二甲基亚砜(90%) 为致孔剂,通过非共价结合法制备对姜黄素具有靶向选择性的分子印迹聚合物,用于分离纯化姜黄提取液中该成分,测得聚合物对姜黄素的IF 值为3.5；Sedghi 等［10］在分子印迹聚合物基础上辅以四氧化三铁纳米粒子,以丙烯酸修饰后β-环糊精和NIPAM 为功能单体,姜黄素为目标靶分子,制备含磁性纳米粒子的热敏分子印迹聚合物(TMMIP),它结合了磁性材料的良好超顺磁性和分子印迹聚合物的高选择性吸附,在特异性吸附过程完成后通过外加磁场,即可实现对吸附剂与吸附液的分离,并且省去离心步骤,具有快速、高效、低成本的优点。

2 含有量测定

2.1 中药材及其提取物中 中药材及其中药提取物中姜黄素含有量测定方法主要有分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱法串联荧光或质谱检测、气相色谱串联质谱、高效毛细管区带电泳法等。杨海玲等［11］采用RP-HPLC 并建立一测多评法对广西姜黄饮片中3 种姜黄素含有量进行测定,方法简单、快速、准确,能够在对照品短缺的情况下用于姜黄多指标成分测定；Anubala［12］建立了一种简便、快速、高效的非水毛细管电泳法(NACE)来同时测定姜黄草药中3 种姜黄素,通过超声提取出色素粗提液,过滤后直接注射在具有反向极性的熔融石英毛细管中,辅以28 kV 的电压进行分离测定,3 种姜黄色素的检出限和定量限分别小于5、14.6 μg/mL；Shen 等［13］以加压液相萃取法萃取姜黄素,液相色谱-串联质谱法同时测定莪术、郁金中3 种姜黄素含有量,分析时间明显缩短,溶剂消耗少。

2.2 中药制剂中 严建伟等［14］采用荧光分光光度法测定姜黄胶囊制剂中姜黄素含有量,以四氢呋喃为溶剂,姜黄素的激发波长、发射波长分别为442、475 nm,线性范围0.010～0.40 μg/mL,最低检测浓度5 ng/mL,该方法简便、快速、灵敏,但所用溶剂为四氢呋喃,毒性较大,不易回收,不符合绿色化学的要求,故有一定局限性；黄宝美等［15］通过毛细管电泳柱端安培检测法对脂可平胶囊中姜黄素含有量进行测定,以微Pt 为工作电极,电位为+1.0 V,以甲醇-乙醇-水(5 ∶2 ∶3) 为非水介质,磷酸二氢钾和硼砂(pH 9.5) 为缓冲体系,与高效液相色谱法相比具有简便、快速、准确、消耗试剂少、测试费用低、不污染环境等优点。然而,以上2 种方法操作繁琐,检测灵敏度不高,在后续发展中并未被广泛使用。

近年来,HPLC 法已被默认为中药制剂含有量首选测定方法,如肖会敏［16］采用HPLC 法测定复方姜黄片制剂中姜黄素含有量,具有分析速度快、方法重复性好、专属性强的特点。而且该成分含有量测定方法不断更新发展,如库伦滴定法、薄层扫描法、紫外分光光度法、液相色谱联用质谱法、气相色谱联用质谱法等,体外分析方法见表1。

表1 姜黄素体外分析方法

由表可知,在本文所统计的33 篇相关文献中有13 篇为HPLC 法,可见该方法具有普遍实用性,检测限可达到0.01 ng,而且该方法操作简单,检测灵敏度比紫外分光光度法、薄层色谱法高,也比液相色谱联用质谱法经济,更易被大众接受。

2.3 体内分析

2.3.1 样品前处理 常用的生物样品前处理方法有液-液萃取法、蛋白沉淀法、固相萃取法,而目前应用于姜黄素的主要为液-液萃取法和蛋白沉淀法。许汉林等［43］以乙酸乙酯进行液-液萃取,而袁凯龙等［44］以二氯甲烷进行液-液萃取,它作为萃取剂时相对其他有机溶剂更有效,但其毒性较大,有一定局限性；蛋白沉淀法常用乙腈或甲醇等有机溶剂使蛋白沉淀,与液液萃取相比其前处理速度快,但样品浓度容易被稀释,易造成色谱柱堵塞等问题,Li 等［45］用乙腈在96 孔板上将血浆样品进行沉淀,该方法简便易行,处理速度快,样品浓度稀释倍数少,满足FDA 对灵敏度的要求,并且蛋白沉淀完全,对色谱柱损伤减少,故在一定程度略优于液液萃取。

2.3.2 分析方法建立 相对于体内分析,体外分析方法大多针对基体较简单的体系,而并非复杂的生物样品。对姜黄素进行药动学研究后发现,该成分几乎不溶于水,体内吸收较差,易被代谢,故急需建立其体内分析方法。目前,体内分析应用较多的方法是HPLC 法,也是姜黄素主要分析方法,此外还有LC/MS-MS、UPLC/MS-MS、毛细管电泳法等,见表2。

表2 姜黄素体内分析方法

高效毛细管电泳(CE) 是快速、简便、灵敏的分离技术,相对于HPLC 毛细管电泳具有耗时短、高效、进样量少、经济等特点,但其重复性较差；荧光分光光度法具有分析灵敏度高、选择性好、样品用量少、操作简便的特点,但其根据物质荧光谱线位置及其强度进行定性鉴定和定量测定,而中药材及其复方制剂成分复杂,具有荧光性的物质可能不只有一个,故该方法推广使用具有局限性；GC/MS-MS 检测限、灵敏度均较高,可经谱库检索,精准定量,但所分析物质必须为可气化、易挥发性,故通常需要衍生化样品,导致前处理复杂且费时；HPLC/MS-MS 法灵敏度高,专属性好,干扰少,而且UPLC/MS-MS 法较其灵敏度更高,可有效缩短分析周期,但是LC/MS-MS 仪器价格昂贵,消耗大,基质效应难以克服；Li 等［45］所采用的HPLC-UV 法虽然灵敏度不如LC/MS-MS,但符合FDA 要求,并且分析周期仅为3 min,与常规LC/MS-MS 分析周期接近,性价比更高。

3 结语

目前,姜黄素依仍然是当今药学、食品科学等方面的研究热点,有关该成分提取分离方法、体内外分析技术已有大量文献报道,但都各有优劣。因此,需不断发掘更新,弥补不足,以期开发出一种更经济、环保、高效的方法来提取分离、分析测定姜黄素。