绿萝花化学成分及其抗氧化活性

董俊丽, 黄传奇, 黄 伟, 马浩然, 刘剑敏

(武汉市第一医院,湖北 武汉430022)

藏药绿萝花来源于瑞香科结香属植物滇结香Edgeworthia gardneri(Wall.)Meisn.的花蕾,又名黄金葛、石柑子、马蹄金,主要分布于西藏高海拔寒冷地带,据《藏医养身图说》 介绍,其作为1种民间藏药已有很长的历史,通常以泡水饮用的方式来预防和治疗高血糖、高血脂、高血压以及脉管炎等慢性疾病［1-3］。有文献报道,绿萝花粗提物有多种药理活性, 如抑制α-葡糖苷酶［4-5］、 抗氧化［6-7］、调节免疫［8］等,但对其化学成分报道较少,因此限制了在药物开发方面的应用。为了进一步了解绿萝花活性物质基础,课题组对该植物进行了化学成分和生物活性研究。

1 材料

Bruker AM-600 核磁共振仪 (美国Bruker 公司)；AE-240 电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；HP1100 型系列高效液相色谱仪(美国惠普公司)；ZORBAX SB-C18色谱柱(美国Agilent 公司)；SHB-ⅢA 循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；KQ-250B 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。 Sephadex LH-20 (20 ～100 μm,美国Amersham Biosciences 公司)；硅胶(100 ～200、300 ～400 目)、薄层层析硅胶板(青岛海洋化工厂)；ODS-A C18反相填充材料(40 ～60 μm,日本YMC 公司)；MCI-gel CHP-20P (瑞士Pharmacia 公司)。液相用试剂为色谱纯(美国默克公司)；其余试剂均为分析纯(北京化工厂)。绿萝花于2016 年购自西藏林芝香巴拉土特产公司,经武汉市第一医院余南才鉴定为瑞香科结香属滇结香Edgeworthia gardneri (Wall.) Meisn.的干燥花蕾。

2 提取与分离

取绿萝花粗粉4.5 kg,室温下用乙醇浸泡3 次(25 L×3,5 d/次),合并提取液,减压蒸回收有机溶剂后,静置过夜,滤除层积色素,滤液用乙酸乙酯萃取至无色,合并浓缩得到乙酸乙酯萃取物约253 g,用250 g 硅胶拌样(100 ～200 目),750 g(200～300 目)硅胶干法装柱,以不同比例的二氯甲烷-丙酮(10 ∶1、8 ∶2、6 ∶4、0 ∶1) 梯度洗脱,TLC 检测, 合并相同组分, 得Fr.A ～Fr.E。Fr.C 静置后有固体物析出,过滤得到大量白色沉淀,滤液过RP-18 柱,不同比例甲醇-水梯度洗脱后进一步经Sephadex LH-20(氯仿-甲醇,1 ∶1)反复纯化得化合物1 (78 mg)、2 (56 mg)、3(71 mg)。Fr.B 用纯甲醇溶解,经MCI 柱,不同比例甲醇-水(4 ∶6、6 ∶4、8 ∶2、10 ∶0) 梯度洗脱,样品(60%、80%甲醇洗脱部分) 经RP-18、Sephadex LH-20 柱(氯仿-甲醇,1 ∶1) 反复纯化得化合物4(7 mg)、5(13 mg)、6(7 mg)、7(6 mg)、8(9 mg)。Fr.D 用纯甲醇溶解,经MCI柱,不同比例甲醇-水(3 ∶7、5 ∶5、7 ∶3、10 ∶0) 梯度洗脱,样品(30%、50%甲醇洗脱部分)经RP-18、Sephadex LH-20 柱(氯仿-甲醇,1 ∶1)反复纯化得化合物9(18 mg)、10(12 mg)、11(17 mg)、12(11 mg)。

3 结构鉴定

化合物1：白色粉末 (二氯甲烷-甲醇),与FeCl3-K3(CN)6反应呈阳性。1H-NMR(600 MHz,DMSO-d5)δ：6.37(1H,d,J ＝10.2 Hz,H-3),8.03(1H,d,J ＝10.2 Hz,H-4),7.69(1H,d,J ＝9.6 Hz,H-5),7.08(1H,dd,J ＝9.0,2.4 Hz,H-6),7.14(1H,d,J ＝3.6 Hz,H-8),7.89(1H,s,H-4′),6.98(1H,s,H-5′),6.80(1H,s,H-8′)；13C-NMR(150 MHz,DMSO-d5)δ：160.0(C-2),113.9(C-3),143.5(C-4),129.9(C-5),113.0(C-6),157.1(C-7),102.6(C-8),155.0(C-9),114.3(C-10),159.9(C-2′),135.3(C-3′),131.8 (C-4′), 112.2 (C-5′), 144.1 (C-6′),146.6 (C-7′), 103.8 (C-8′), 149.9 (C-9′),110.0(C-10′)。以上数据与文献［9］ 基本一致,故鉴定为白瑞香素。

化合物2：白色粉末(二甲基亚砜),ESI-MS m/z：178［M+H］+,：-34.1° (c ＝0.31,Pyr), 与FeCl3-K3(CN)6反应呈阳性。1H-NMR(600 MHz,DMSO-d5) δ：6.19 (1H,d,J ＝9.6 Hz,H-3),7.90(1H,d,J ＝9.6 Hz,H-4),7.02(1H,d,J ＝8.8 Hz,H-5),6.85(1H,d,J ＝8.8 Hz, H-6)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d5) δ：160.6 (C-2), 111.3 (C-3), 145.0 (C-4),118.9 (C-5), 112.6 (C-6), 149.8 (C-7),132.3(C-8),143.9 (C-9),112.0 (C-10)。以上数据与文献［10］ 基本一致,故鉴定为瑞香素。

化合物3：白色粉末(二甲基亚砜),ESI-MS m/z：352［M+H］+,：-27.3° (c ＝0.42,Pyr), 与FeCl3-K3(CN)6反应呈阳性。1H-NMR(600 MHz,DMSO-d5) δ：6.37 (1H,d,J ＝9.6 Hz,H-3),8.03(1H,d,J ＝9.6 Hz,H-4),7.70(1H,d,J ＝8.8 Hz, H-5),7.11 (1H,dd,J ＝8.4,2.4 Hz,H-6),7.17(1H,d,J ＝2.4 Hz,H-8),7.86(1H,s,H-4′),7.21 (1H,s,H-5′),6.86(1H,s,H-8′),3.81(3H,s,OCH3)；13CNMR (150 MHz, DMSO-d5) δ： 160.0 (C-2),113.9 (C-3), 144.2 (C-4), 129.9 (C-5),113.5 (C-6), 157.0 (C-7), 102.7 (C-8),155.1 (C-9), 114.4 (C-10), 159.5 (C-2′),135.8 (C-3′), 130.9 (C-4′), 109.5 (C-5′),145.6 (C-6′), 147.5 (C-7′), 104.1 (C-8′),150.5(C-9′),110.3(C-10′),56.0(C-OCH3)。以上数据与文献［11］ 基本一致,故鉴定为西瑞香素。

化合物4：无色针晶(丙酮),365 nm 下可见亮蓝色荧光, 与FeCl3-K3(CN)6反应呈阳性,ESI-MS m/z： 185.0 ［M+Na］+。1H-NMR (600 MHz,DMSO-d5) δ：6.12(1H,d,J ＝9.6 Hz,H-3),7.81(1H,d,J ＝9.6 Hz,H-4),7.45(1H,d,J ＝13.2 Hz,H-5),6.79(1H,dd,J ＝13.2,3.0 Hz,H-6),6.70(1H,d,J ＝3.0 Hz,H-8)；13C-NMR(150 MHz,DMSO-d5) δ：163.0(C-2),111.3 (C-3), 148.5 (C-4), 130.7 (C-5),113.5 (C-6), 163.5 (C-7), 103.0 (C-8),157.2(C-9),112.5 (C-10)。以上数据与文献［12］ 基本一致,故鉴定为伞形花内酯。

化合物5：白色粉末(二氯甲烷-甲醇),ESIMS m/z：193［M+H］+,365 nm 下可见亮蓝色荧光,与FeCl3-K3(CN)6反应呈阳性。TLC 分析与东莨菪内酯标准品Rf值一致,两者混合后熔点不下降,鉴定为东莨菪内酯。

化合物6：黄棕色粉末(丙酮),浓硫酸-乙醇试剂反应显棕褐色。1H-NMR(600 MHz,MeOH-d4)δ：6.27(1H,d,J ＝9.6 Hz,H-3),7.60(1H,d,J ＝9.0 Hz, H-4), 6.90 (1H, s, H-5), 6.83(1H,s,H-8),3.66(3H,s,6-OCH3),4.53 ～4.72 (2H, m, H-1′), 3.64 (1H, m, H-2′),1.45(3H,s,H-4′),1.40 (3H,s,H-5′)；13CNMR(150 MHz, MeOH-d4) δ： 161.5 (C-2),113.6 (C-3), 144.1 (C-4), 109.5 (C-5),147.2 (C-6), 153.8 (C-7), 100.8 (C-8),150.8(C-9),112.2 (C-10),56.5 (6-OCH3),68.9(C-1′),60.9 (C-2′),56.6 (C-3′),25.2(C-4′),18.5(C-5′)。以上数据与文献［13］ 基本一致,故鉴定为7-(2,3-环氧-3-甲氧基丁氧基) -香豆素。

化合物7：白色针晶(二氯甲烷-甲醇),365 nm 下可见亮蓝色荧光,与FeCl3-K3(CN)6反应呈阳性, ESI-MS m/z： 193 ［M+H］+, 191 ［MH］-。1H-NMR (600 MHz, MeOH-d4) δ： 6.32(1H,dd,J ＝9.6 Hz,H-3),7.97(1H,d,J ＝9.6 Hz,H-4),7.21(1H,s,H-5),4.01(3H,s,7-OCH3),6.87(1H,s,H-8)；13C-NMR(150 MHz,MeOH-d4) δ：164.4(C-2),112.8(C-3),146.4(C-4),110.3(C-5),147.3 (C-6),153.2 (C-7),104.5(C-8),151.6(C-9),112.6(C-10),57.2(C-OCH3)。以上数据与文献［14］ 基本一致,故鉴定为异莨菪内酯。

化合物8：无色固体粉末(丙酮),与FeCl3-K3(CN)6反应呈阳性, ESI-MS m/z：320 ［M+H］+。1H-NMR (600 MHz,CDCl3) δ：6.18 (1H,s,H-2),2.41(1H,t,J ＝7.8 Hz,H-1′),1.48(2H,q,J ＝7.2 Hz,H-2′),1.20 (24H,H-3′～14′),0.84(3H,t,J ＝6.6 Hz,H-15′)；13C-NMR(150 MHz,CDCl3) δ：155.5(C-1,3),99.0(C-2),107.0 (C-4,6), 145.2 (C-5), 34.7 (C-1′), 28.2-30.3 (C-2′ ～ 12′), 31.0 (C-13′),21.9(C-14′),13.2 (C-15′)。以上数据与 文献［15］ 基本一致,故鉴定为5-十五烷基间苯二酚。

化合物9： 无色针晶 (甲醇), 与FeCl3-K3(CN)6反 应 呈 阳 性, ESI-MS m/z： 153 ［MH］-。1H-NMR (600 MHz, MeOH-d4) δ： 7.67(1H,dd,J ＝1.8,1.8 Hz,H-2),7.65(1H,d,J ＝2.4 Hz,H-6),6.94(1H,d,J ＝8.4 Hz,H-5)；13C-NMR (150 MHz, MeOH-d4) δ： 170.2(-C ＝O), 152.9 (C-4), 145.8 (C-3), 125.5(C-6),123.3(C-1),116.2 (C-5),114.0 (C-2)。以上数据与文献［16］ 基本一致,故鉴定为3,4-二羟基苯甲酸。

化合物10：淡黄色粉末(甲醇),与FeCl3-K3(CN)6反 应 呈 阳 性, ESI-MS m/z： 515 ［MH］-。1H-NMR (600 MHz, MeOH-d4) δ： 2.10(4H,m,H-2,6),5.52 (1H,s,H-3), 4.97(1H, brs, H-4), 4.19 (1H, m, H-5), 6.95(2H,brs,H-2′,2″),6.65(2H,m,H-5′,5″),6.81(2H,m,H-6′,6″),7.44(2H,d,J ＝15.6 Hz,H-7′,7″),6.19(2H,d,J ＝15.6 Hz,H-8′,8″)；13C-NMR(150 MHz,MeOH-d4) δ：173.4(-COOH),76.2(C-1),41.5(C-2),66.8(C-3),75.8(C-4), 70.3 (C-5), 37.7 (C-6), 128.0(C-1′),115.5(C-2′),147.0(C-3′,3″),149.9(C-4′),116.8(C-5′,5″),123.5(C-6′),147.7(C-7′, 7″), 115.1 (C-8′), 168.7 (C-9′),128.0 (C-1″), 115.3 (C-2″), 149.8 (C-4″),123.5(C-6″),115.2(C-8″),168.8(C-9″)。以上数据与文献［17］ 基本一致,故鉴定为异绿原酸B。

化合物11：淡黄色粉末(甲醇),与FeCl3-K3(CN)6反 应 呈 阳 性, ESI-MS m/z： 515 ［MH］-。1H-NMR (600 MHz, MeOH-d4) δ： 2.25(4H,m,H-2,6),4.40 (1H,m,H-3),5.18(1H,d,J ＝8.0 Hz,H-4),5.68(1H,brs,H-5),7.03(1H,brs,H-2′),6.78 (1H,brs,H-5′),6.94(2H,m,H-6′,6″),7.54(1H,d,J ＝15.6 Hz,H-7′),6.24 (1H,d,J ＝16.2 Hz,H-8′),7.05(1H,brs,H-2″),6.79 (1H,brs,H-5″),7.63(1H,d,J ＝15.6 Hz,H-7″),6.35(1H,d,J ＝16.2 Hz,H-8″)；13C-NMR (150 MHz, MeOHd4)δ：176.0(-COOH),74.9(C-1),37.2(C-2), 67.8 (C-3), 74.5 (C-4), 68.3 (C-5),38.1 (C-6), 126.3 (C-1′), 113.9 (C-2′),145.4(C-3′),148.4 (C-4′,4″),115.3 (C-5′,5″), 121.9 (C-6′, 6″), 146.4 (C-7′), 113.5(C-8′), 167.0 (C-9′), 126.4 (C-1″), 113.9(C-2″), 145.2 (C-3″), 146.5 (C-7″), 113.3(C-8″),167.3 (C-9″)。 以上数据与文献 ［18］基本一致,故鉴定为异绿原酸C。

化合物12：黄绿色结晶(甲醇),盐酸-镁粉反应呈阳性,ESI-MS m/z：465［M+H］+。1H-NMR(600 MHz,MeOH-d4) δ：6.30 (1H,d,J ＝2.4 Hz,H-6),6.42(1H,d,J ＝1.8 Hz,H-8),7.82(1H,d,J ＝1.8 Hz,H-2′),6.95(1H,d,J ＝8.4 Hz,H-5′),7.67 (1H,dd,J ＝2.4,2.4 Hz,H-6′),3.33 ～3.58(4H,m,sugar-H),5.35(1H,d,J ＝7.8 Hz,H-1″),3.81(1H,dd,J ＝2.4,2.4 Hz,Hα-6″),3.69(1H,dd,J ＝5.4,5.4 Hz,Hβ-6″)；13C-NMR(150 MHz,MeOH-d4)δ：159.2(C-2),136.0(C-3),179.7(C-4),168.4 (C-5),100.0 (C-6), 166.3 (C-7), 95.0C-8), 158.7(C-9), 106.0 (C-10), 123.4 (C-1′), 116.3(C-2′), 146.0 (C-3′), 150.3 (C-4′), 117.7(C-5′),123.5(C-6′),104.6(C-1″),71.4(C-2″),78.4 (C-3″),62.7 (C-4″),78.5 (C-5″),60.6(C-6″)。以上数据与文献［19］ 基本一致,故鉴定为异槲皮苷。

4 抗氧化活性筛选

4.1 供试品溶液制备 取各化合物1 mg,适量乙醇溶解,棕色量瓶定容至5 mL,得200 mg/L 母液,取1 mL 分 别 稀 释 成100、 50、 25、 12.5、6.25 mg/L 的待测液。取1.0×10-4mol/L DPPH 乙醇溶液2 mL,加入2 mL 上述不同质量浓度的待测液,充分摇匀后,室温下避光静置30 min 后测定517 nm波长处的OD 值,作为样品OD 值；2 mL DPPH 液与2 mL 乙醇溶液测定517 nm 波长处的OD 值,作为空白OD 值。测定前,以50%乙醇溶液调零,BHT 作为对照,计算化合物对DPPH 自由基的清除率,公式为清除率＝［(空白OD 值-样品OD 值)/空白OD 值］ ×100%。采用PRISM 5.0软件,以化合物质量浓度与其对应的DPPH 自由基清除率进行线性回归,得回归方程,测定EC50(50%DPPH 清除时化合物浓度)。

4.2 统计分析 采用SPSS 11.0 软件对化合物的抗氧化活性进行组间差异分析(t 检验),P＜0.05表示具有显著性差异。

4.3 抗氧化活性 结果见表1。化合物1～12 均显示了良好的抗氧化活性(EC500.131～0.713 μmol/L),9～11 显著高于对照品BHT(0.166 μmol/L)。含羟基取代的小分子酚酸都具有较好的抗氧化活性,体现了结构类型和活性对应的构效关系。

表1 抗氧化活性实验EC50值n=3）Tab.1 EC50 values in antioxidant activities tests，n=3）

表1 抗氧化活性实验EC50值n=3）Tab.1 EC50 values in antioxidant activities tests，n=3）

注：BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)为阳性对照

化合物 EC50/(μmol·L-1)1 0.275±0.013 2 0.268±0.011 3 0.520±0.027 4 0.681±0.010 5 0.552±0.104 6 0.713±0.086 7 0.491±0.023 8 0.219±0.007 9 0.156±0.051 10 0.147±0.013 11 0.131±0.006 12 0.173±0.009 BHT 0.166±0.004