新型免疫分子TRIM23参与斑马鱼抗嗜水气单胞菌免疫应答

伍冰倩　刘妮妮　杨鑫豪　张靓　周泽建　张红　匡奕敩　赵珩

摘要：为获得纯化的斑马鱼TRIM23（tripartite motif 23）重组蛋白并研究其免疫功能，试验采用逆转录PCR（RT-PCR）技术扩增TRIM23全长序列，将其与原核表达载体pGEX-4T-1连接并转化至E.coli Rosetta感受态细胞，用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，利用谷胱甘肽巯基转移酶（GST）蛋白纯化介质纯化目的蛋白后，将其与嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）孵育，检测抑菌活性。结果显示，重组表达载体pGEX-TRIM23在宿主菌Rosetta中表达出约91 ku的重组蛋白，且蛋白部分以可溶形式存在于上清中，经体外抑菌试验检测发现，TRIM23蛋白能够抑制嗜水气单胞菌的增殖。基于以上研究，推测TRIM23在斑马鱼抗细菌免疫应答过程中发挥作用。

关键词：新型免疫分子;TRIM23;斑马鱼;原核表达;嗜水气单胞菌

中图分类号： S942.5  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）04-0153-04

近年来，我国的水产养殖业快速发展，但随着高密度集约化养殖模式的大面积推广，鱼类疾病时有发生，其中细菌性疾病暴发较频繁，是水产养殖面临的主要难题之一[1]。嗜水气单胞菌是水产养殖中很常见的致病菌，属于弧菌科（Vibrionaceae）气单胞菌属（Aeromonas），它在水环境中广泛存在，能感染鲤鱼、银鲫、草鱼、青鱼及中华鳖等绝大多数淡水鱼类，并可引发细菌性败血症，该鱼病危害范围广，流行季节长，可导致鱼类大量死亡，造成巨大的经济损失[2]。因此，嗜水气单胞菌受到广泛关注，常作为一种代表性病原菌被用于相关研究中。

在长期进化过程中，真核生物体内逐渐形成了特定的宿主蛋白来抵御病原体的入侵，TRIM（tripartite motif，三结构域蛋白家族）就属于其中一类，该蛋白几乎存在于所有多细胞动物中，因N端拥有保守的由1个RING结构域、1个或2个B-box结构、1个卷曲螺旋（coil-coiled）组成的RBCC基序，所以也被称为RBCC蛋白[3]，许多研究表明，TRIM蛋白具有抗菌、抗病毒功能，能够参与调节相关免疫信号通路[4]。鱼类TRIM蛋白由ftr基因和btr基因编码，ftr基因起源不明，是鱼类所特有的，在病毒侵染下能够表达编码蛋白，而btr基因起源于哺乳动物TRIM39的直接同源基因。ftr基因和btr基因编码的TRIM蛋白种类非常多，仅在斑马鱼中就存在240种[5-6]，但关于其研究进展缓慢，至今绝大部分鱼类TRIM蛋白家族成员的功能还是未知的。

TRIM23蛋白是TRIM蛋白家族成员之一，拥有ARF结构域[7]。目前研究表明，人TRIM23蛋白是免疫信号通路中的重要调节因子，参与调控机体的先天性抗病毒免疫反应及炎症反应，Arimoto等发现病毒侵染细胞时，TRIM23能够使NEMO分子的K27泛素化，进而激活NF-κB及IRF3信号通路[8];另外，Poole等研究表明，TRIM23通过与巨细胞病毒的基因产物UL144相互作用，能够加强UL144与TRAF6之間的互作，从而上调NF-κB的活性[9]。TRIM蛋白在硬骨鱼中具有免疫活性，推测TRIM23在鱼类免疫方面也起到了作用。因此，本研究以斑马鱼TRIM23为研究对象，构建pGEX-TRIM23原核表达载体，对蛋白进行诱导表达及纯化，通过将TRIM23与嗜水气单胞菌在体外孵育，初步研究TRIM23对嗜水气单胞菌繁殖的影响，为深入研究斑马鱼TRIM23的免疫功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验地点 试验于2016年6月至2017年9月于中央民族大学生命与环境科学学院进行。

1.1.2 试验动物 斑马鱼由笔者所在实验室繁殖保存，饲养约1周后，解剖分离其肾脏，立即用液氮处理后，置于-80 ℃保存备用。

1.1.3 表达载体及菌株 pGEX-4T-1原核表达载体、嗜水气单胞菌菌株由笔者所在实验室保存;E.coli Top10感受态细胞及E.coli Rosetta（DE3）感受态细胞均购自天根生化公司。

1.1.4 酶和试剂 TRIzol Reagent，购自拜力生物公司;M-MLV逆转录酶，购自普洛麦格公司;Pfu高保真酶、pEASY-Blunt克隆载体，购自全式金生物公司;限制性内切酶EcoR Ⅰ、Sal Ⅰ及T4 DNA连接酶，购自NEB公司;Taq聚合酶、DL2000 DNA marker、6×loading buffer，购自TaKaRa公司;质粒小量提取试剂盒、凝胶回收试剂盒，购自天根生化公司;预染蛋白marker，购自Fermentas公司;谷胱甘肽巯基转移酶（GST）蛋白纯化介质，购自碧云天公司;氨苄青霉素、异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、三羧基甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基硫酸钠（SDS）、溶菌酶，购自索莱宝科技公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 在GenBank上得到斑马鱼TRIM23基因的全长序列，根据所得序列，用Prime 5.0软件设计合成1对寡核苷酸引物，上游引物包含EcoR Ⅰ酶切位点，序列为5′-CGGAATTCTATGGCCGCTGCTGTCG-3′，下游引物包含Sal Ⅰ酶切位点，序列为5′-GCGTCGACCGGCCACATCCAGAACCC-3′，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 斑马鱼TRIM23基因的扩增 取成年斑马鱼的肾脏，用TRIzol法提取肾脏总RNA，逆转录获得cDNA，再以cDNA为模板PCR扩增TRIM23全长序列。PCR反应体系总体积为 50 μL，含1 μL模板DNA，5 μL 10×buffer，2.5 μL 10 μmmol/L 上游引物，2.5 μL 10 mmol/L下游引物，1.5 μL 2.5 mmol/L dNTP，1 μL Pfu高保真酶，36.5 μL ddH2O。PCR扩增条件如下：94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸4 min，循环32次;72 ℃延伸10 min，4 ℃终止。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后回收，连接至pEASY克隆载体，转化到E.coli Top10感受态细胞中，筛选阳性克隆。

1.2.3 重组载体pGEX-TRIM23的构建 利用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切pEASY-TRIM23克隆载体及pGEX-4T-1 表达载体，分别回收纯化酶切产物，用T4 DNA连接酶将2个目的片段于16 ℃连接过夜后，将连接产物转化至E.coli Top10感受态细胞，在含有氨苄青霉素（Amp）LB固体培养基上筛选转化菌落，提取质粒，用限制性内切酶 EcoR Ⅰ 和Sal Ⅰ进行双酶切验证，筛选阳性克隆送至北京睿博兴科生物技术有限公司测序。

1.2.4 TRIM23蛋白的诱导表达 将测序正确的pGEX-TRIM23重组载体转化至E.coli Rosetta感受态细胞中，筛选转化菌落。挑选单克隆接种至含有Amp LB液体培养基中，37 ℃、220 r/min振荡培养过夜。次日，按1 ∶ 100的比例将培养过夜的菌液转接于200 mL LB液体培养基中，37 ℃、220 r/min 继续培养至D600 nm=0.6左右，加入IPTG，设置终浓度为0.5、1.0 mmol/L，30 ℃、170 r/min诱导培养5 h。离心收集菌体，加入适当PBS（即磷酸缓冲盐溶液，含140 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L KH2PO4，pH值为7.3）重悬，超声破碎裂解，4 ℃、10 000 r/min 离心20 min，分别取 20 μL 裂解液上清和沉淀进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），检测融合蛋白的表达情况。

1.2.5 TRIM23蛋白的纯化 将收集的菌体重悬于PBS中，加入终浓度为1 mg/mL的溶酶菌，混匀，冰上放置30 min，超声破碎，然后于4 ℃、10 000 r/min离心20 min，收集上清。往上清中加入平衡好的GST标签蛋白纯化介质，4 ℃缓慢摇动60 min后，将混合物装入1 mL亲和层析纯化柱中，打开纯化柱底部的盖子，在重力作用下使柱内液体流出，洗涤纯化柱5次，每次加入2个柱体积的PBS，接着洗脱目的蛋白10次，每次用1个柱体积的洗脱缓冲液[50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L 谷胱甘肽（GSH），pH值为8.0]，分别收集各穿柱液进行SDS-PAGE检测。

1.2.6 体外检测TRIM23蛋白对嗜水气单胞菌的影响 将嗜水气单胞菌接种至LB液体培养基中，28 ℃振荡培养过夜，按1 ∶ 100的比例将培养过夜的菌液转接于100 mL LB液体培养基中，28 ℃振荡培养3 h，10 000 r/min离心1 min收集菌体并用TBS（即三乙醇胺缓冲盐溶液，含50 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，pH值为7.5）冲洗3次，然后用TBS+Ca2+缓冲液（含 10 mmol/L CaCl2的TBS缓冲液）重悬至1×105 CFU/mL，备用。

1.2.6.1 检测不同浓度TRIM23蛋白对嗜水气单胞菌的影响 将细菌重悬液分装到1.5 mL无菌离心管中，每管 100 μL，加入纯化的TRIM23蛋白，设置浓度梯度0、6、12、24、30、36、42 μg/mL，用TBS补足总体积至200 μL，25 ℃孵育3 h，按一定比例稀释菌液，取50 μL均匀涂布于LB固体培养上，28 ℃培养过夜，计数。

1.2.6.2 检测TRIM23在不同时间对嗜水气单胞菌的影响 将细菌重悬液分装到1.5 mL无菌离心管中，每管100 μL，加入纯化的TRIM23蛋白（蛋白终浓度为30 μg/mL），用TBS补足总体积至200 μL，对照组不加TRIM23蛋白，设置时间梯度0、1、2、4 h，25 ℃孵育。按一定比例稀释菌液，取50 μL均匀涂布于LB固体培养上，28 ℃培养过夜，计数。

2 结果与分析

2.1 TRIM23基因的扩增

由图1可知，以斑马鱼肾脏cDNA为模板进行TRIM23基因的PCR扩增，产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，得到 1 731 bp 的单一条带，与目的基因大小相符。

2.2 重组载体pGEX-TRIM23的双酶切鉴定

将重组载体pGEX-TRIM23用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切后，经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，在接近 2 000 bp 处有1条被切下的条带，说明TRIM23基因已被连入pGEX-4T-1质粒中。对所得阳性克隆进行基因测序，测序结果表明，连入pGEX-4T-1载体中的TRIM23基因与GenBank中TRIM23基因的碱基序列一致，阅读框正常，说明原核表达载体pGEX-TRIM23构建成功。

2.3 TRIM23蛋白的诱导表达

将重组载体 pGEX-TRIM23 转化到Rosetta感受態细胞中，37 ℃、220 r/min培养至D600 nm为0.6时，加入终浓度分别为0.5、1.0 mmol/L的IPTG诱导3 h，收集细菌超声裂解，分别取裂解液上清和沉淀进行SDS-PAGE检测。由图3可知，在泳道3～4和泳道6～7中，95 ku区域均出现了目的条带，融合蛋白分子量大小约为91 ku，与预期目的蛋白大小一致，表明TRIM23蛋白被成功诱导表达，且以可溶性和包涵体的形式分别存在于上清及沉淀中。

2.4 TRIM23蛋白的纯化

将收集的菌液用超声破碎裂解后，离心获取上清，与GST标签蛋白纯化介质孵育，分别取上样流穿液、洗涤液、洗脱液进行SDS-PAGE分析。由图4可知，泳道4～5为与GST标签蛋白纯化介质孵育后的流穿液，其中未出现目的条带，说明TRIM23蛋白已经特异性结合到纯化介质上，经PBS多次洗涤纯化柱，泳道6中基本不存在明显杂带，说明非特异性结合在纯化介质上的杂蛋白已经被洗脱下来，泳道7～8为蛋白洗脱液，在95 ku区域内均出现明显条带，说明TRIM23蛋白被成功洗脱下来。

2.5 TRIM23對嗜水气单胞菌的影响

2.5.1 不同浓度TRIM23蛋白对嗜水气单胞菌的影响 将终浓度为0、6、12、24、30、36、42 μg/mL的TRIM23蛋白分别与嗜水气单胞菌在室温下孵育3 h，随后测定活细菌数，由图5可知，当TRIM23蛋白浓度≥12 μg/mL时，试验组的细菌数量均低于空白对照组，且随着蛋白浓度的增加，细菌数量呈现减少的趋势， 但当蛋白浓度增加至30 μg/mL时，细菌数量趋于稳定。

2.5.2 TRIM23蛋白在不同时间对嗜水气单胞菌的影响 将终浓度为24 μg/mL的TRIM23蛋白与嗜水气单胞菌分别孵育0、1、2、4 h，测定活细菌数，由图6可知，在整个孵育过程中，空白对照组及TRIM23处理试验组的细菌数均有一定的增长，但孵育1、2、4 h时，TRIM23处理试验组的细菌数均低于对照组的细菌数，说明TRIM23蛋白能够抑制嗜水气单胞菌的增殖。

3 讨论与结论

TRIM蛋白的免疫功能近年来一直倍受关注，研究成果颇丰，如Yap等发现TRIM5具有限制鼠白血病病毒（murine leukemia virus，简称MLV）的能力[10];TRIM56能够与牛腹泻病毒（bovine diarrhoea virus，简称BDV）的氨基蛋白酶结合，从而限制BDV的复制[11];Uchil等全面分析了人类及小鼠中55种具备抗逆转录病毒活性的TRIM蛋白，发现其中约有20种拥有干扰逆转录病毒进入细胞及释放的能力[12];Gack等研究表明，TRIM25能够泛素化RIG-I，进而激活RIG-I信号通路[13];TRIM21能够与PIN1分子的互作，以阻止PIN1与IRF3的结合，从而增强IRF3的稳定性，最终加强Ⅰ型干扰素的表达[14]。但就目前的研究而言，TRIM蛋白免疫功能的研究主要集中在人、小鼠等物种，而关于鱼类的研究报道很少，尚存在大量空白，因此本研究探讨斑马鱼TRIM23蛋白表达及其对嗜水气单胞菌的影响，为深入研究TRIM23的免疫功能提供实践基础。

细菌性感染是制约水产养殖业发展的一个重要因素[15]，而嗜水气单胞菌是引发淡水鱼类败血症的主要致病菌，一旦感染鱼类，就会造成鱼类的大量死亡[16-18]。为了初步研究TRIM23蛋白的免疫功能，笔者利用含有GST融合标签的pGEX-4T-1原核表达载体进行蛋白的体外表达，获得纯化的TRIM23蛋白后，将其与嗜水气单胞菌孵育，发现该蛋白对嗜水气单胞菌的增殖有一定的抑制作用，这表明TRIM23参与了斑马鱼抗细菌免疫应答反应，但是其具体的作用机制仍需进一步研究，对人TRIM23的研究表明，其在病毒感染时以泛素连接酶身份参与激活NF-κB信号通路，那么在细菌感染过程中，斑马鱼TRIM23能否同样参与调控NF-κB信号通路也有待试验证实。

本研究构建了pGEX-TRIM23原核表达载体，成功获得了纯化的GST-TRIM23融合蛋白，并发现其能够抑制嗜水气单胞菌的增殖，这为探寻与TRIM23相互作用的蛋白，阐明TRIM23参与斑马鱼抗细菌免疫反应的机制奠定了良好的基础。

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