紫萼玉簪HvGASA、HvFAD基因的克隆及表达分析

庄倩倩　 陈少鹏　 刘洪章

摘要：利用RACE技术、Genome Walking技术及PCR技术，从紫萼玉簪中克隆得到长度分别为336、1 320 bp的GASA基因HvGASA和脂肪酸去饱和酶基因HvFAD的cDNA全长序列，分别编码111、399个氨基酸，其中HvFAD基因所编码的蛋白为跨膜蛋白。qRT-PCR分析结果表明，2条基因随自然地温的降低均上调表达，而且在地温降至3 ℃时发生剧烈的表达量变化，说明HvGASA、HvFAD基因与紫萼玉簪的抗寒性具有密切关系。

关键词：紫萼玉簪;HvGASA基因;HvFAD基因;基因克隆;基因表达;抗寒性

中图分类号： S682.1+90.1  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）04-0055-06

紫萼玉簪（Hosta ventricosa）又称紫花玉簪、紫玉簪，为百合科玉簪属多年生宿根草本植物，在我国主要分布于东北、华东、西南、广西等地[1]，自然生长于林下、溪边。紫萼玉簪花紫色、无香味，叶卵圆形，有较高的观赏价值，作为重要的观赏植物被广泛应用于园林地被、花境及盆栽。玉簪属其他植物观赏性状丰富，如具有白色花朵、花朵具有香气等，但这些玉簪属植物多数不耐寒，无法在东北地区自然越冬，这严重阻碍了玉簪属植物在东北地区的应用推广，然而紫萼玉簪具有极耐寒的特性，是唯数不多的能够在东北地区自然越冬的玉簪属植物之一，故推测紫萼玉簪具有其他玉簪属植物所不具备的抗寒相关基因及抗寒机理。本研究通过探究紫萼玉簪中与抗寒功能相关的基因，为今后摸清紫萼玉簪的抗寒机理及利用分子育种方法进行抗寒玉簪新品种培育提供参考。

GASA（gibberellic acid-stimulated Arabidopsis）基因家族最早在拟南芥中发现[2]，后来在很多其他植物中发现了与其相似的蛋白，如水稻（Oryza sativa）OsGASR1基因和OsGASR2基因[3]、草莓（Fragaria ananassa）GAST1-like基因、矮牵牛（Petunia hybrida）GIP基因[4]等。GASA編码基因数量众多，大多数成员受赤霉素（GA）调控[5]。GASA蛋白又称Snakin蛋白，是一类CRP（cysteine-rich peptides）蛋白。CRP蛋白是植物中富含半胱氨酸的小分子多肽，其在植物生长发育和逆境反应中具有重要的作用[6]。GASA蛋白中富含半胱氨酸，半胱氨酸是形成二硫键所必需的，而二硫键的形成对维持蛋白质空间构象的稳定具有非常重要的作用。GASA蛋白在低温、高盐等非生物胁迫应答中具有重要作用，此外也参与多项生长发育活动，如种子萌发、根的形成、茎的生长、花和果实发育及虫害、病菌等生物胁迫，在激素信号转导等过程中亦发挥重要的调控作用[7]。

脂肪酸去饱和酶（fatty acid desaturase，FAD）是不饱和脂肪酸合成途径中重要的酶物质，FAD基因是油酸合成的关键酶基因。当植物处于低温环境时，FAD通过调节脂肪酸不饱和度来调节膜的流动性[8]，保护膜结构不受破坏，从而达到提高植物抗寒性的作用。目前FAD基因在许多植物中被发现及研究，其中有关抗寒性研究的植物种类也很多，包括马齿苋、棉花、橄榄、白芸豆、马铃薯等[9]。此外，不饱和脂肪酸与植物的抗旱[10]、耐盐[11]、抗重金属、抗病、细胞识别以及组织免疫等方面也密切相关[12-13]。

1 材料与方法

1.1 材料采集与处理

从2015年9月15日至11月24日，随着长春地区由秋季转入冬季，气温及地温逐渐降低，每隔7 d于当日07：00进行采样，每次采集的样品依次编号为A～K。每次采样对校园内同地点种植的紫萼玉簪根系进行采集，并测定实时地温（距离地表10 cm处），记录当天最高及最低气温，将根系泥土用去离子水冲洗干净，吸干表面的水分，液氮速冻后置于 -80 ℃ 冰箱保存，具体采样的气候条件见表1。

1.2 DNA提取、总RNA提取、完整性检验及反转录cDNA

紫萼玉簪根系总DNA提取采用改良CTAB法[14]，总RNA提取使用RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA、RNA的完整性、降解程度及是否存在污染，采用超微量紫外光分光光度计测定二者浓度。采用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒（TaKaRa公司）将提取的紫萼玉簪根系RNA进行反转录cDNA，制备好的cDNA置于-20 ℃冰箱保存。

1.3 HvGASA、HvFAD基因的克隆

笔者所在课题组前期进行了紫萼玉簪转录组测序工作，建立了以抗寒性为基础的转录组数据库，测序材料为紫萼玉簪的根系。在转录组测序数据库中筛选出2条功能注释与GASA、FAD相关的差异表达基因（differentially expressed gene，DEG）进行下一步分析，序列在测序数据库中的ID分别为c18557.graph_c0、c60584.graph_c0。在美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）数据库中进行BLASTp比对，发现c18557.graph_c0蛋白序列与石刁柏（Asparagus officinalis）的AoGASA基因（XP_02027448.1）及大蒜（Allium sativum）AsGASA基因（AEX55233.1）分别具有66%、59%的一致性，故命名为HvGASA基因;c60584.graph_c0蛋白序列与石刁柏的脂肪酸去饱和酶AoFAD（XP_0202441744.1）具有85%的一致性，故命名为HvFAD基因。

以紫萼玉簪根系cDNA为模板，采用3′RACE及5′ Genome Walking的方法进行HvGASA、HvFAD基因ORF全长克隆，试验具体操作方法详见3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase（TaKaRa公司）使用说明书及Genome Walking Kit（TaKaRa公司）使用说明书。使用Primer 5.0进行引物设计，并委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行引物合成及测序，引物信息见表2。

1.4 生物信息学分析

利用Ex PASy-Prot Param和Ex PASy-Prot Scale在线分析氨基酸序列的疏水性和理化性质。通过Expasy网站（http：//www.expasy.org/）将该cDNA序列翻译为氨基酸序列。通过NCBI网站的在线BLAST分析工具（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中的BLASTp工具对核苷酸序列进行比对库检（比对数据库选择NR，替换计分矩阵选择BLOSUM62，其他采用默认参数），检索与该蛋白序列相似度较高的序列。然后选取比对结果中E-value较低且Querycover较高的序列，用CLUSTX2进行多序列比对。采用Signal P4.1预测其是否具有信号肽。将多序列比对结果输出为NEXUS格式，用PUAP 4.0和Modeltest 3.7检验最优的氨基酸替换模型，然后在GTR+I+G（广义时间可逆）模型下用最大似然法构建进化树。在NCBI网站使用BLASTp程序进行库检，数据库采用PDB，搜索结果与目的基因氨基酸序列相似性较高且已知蛋白晶体的序列，并选择与目的基因相似度较高且分辨率较高的3个晶体结构作为参考，然后用Modeller 9.1软件，构建三维结构。用PSORT Ⅱ在线分析软件对蛋白质序列进行分析。

1.5 qRT-PCR表达量分析

qRT-PCR使用的引物序列见表2，以报道的Actin基因为内参基因[15]，设置3次重复试验。试验试剂采用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa公司），仪器使用7300 Fast Real Time PCR System（ABI公司）。

2 结果与分析

2.1 总DNA提取、总RNA提取及检验

紫萼玉簪根系总DNA提取凝胶电泳结果见图1，D260 nm/D280 nm为1.925，DNA浓度为486 μg/μL。根系总RNA的凝胶电泳结果见图2，D260 nm/D280 nm为2.031，RNA浓度为 209 μg/μL。

2.2 HvGASA、HvFAD基因的克隆

用3′RACE和5′Genome Walking的方法进行HvGASA、HvFAD基因3′末端和5′末端的克隆，PCR凝胶电泳检测结果见图3，切胶回收测序后，利用DNAMAN进行全长序列拼接后，再进行Blast序列比对，获得具有完整ORF框的2条基因序列：HvGASA（336 bp，图3-a）、HvFAD（1 320 bp，图3-b）。

2.3 生物信息学分析

2.3.1 HvGASA基因

2.3.1.1 理化性质分析、多序列比对 HvGASA基因的序列全长为336 bp，编码的蛋白质全长111个氨基酸，分子量为27.95 ku，等电点（pI）为5.24。利用推测的HvGASA氨基酸序列在NCBI数据库中进行BLASTp搜索，并从其序列比对结果中挑选相似性较高的12条GASA蛋白序列，进一步与HvGASA进行多序列比对，结果如图4所示。通过SMART网站及ExPASy-ProtScale网站对氨基酸序列进行分析，发现GASA蛋白N端1～23个氨基酸为信号肽序列（图4中方框区域），C末端具有由12个半胱氨酸残基组成的高度保守的GASA结构域（图4中箭头所指部位），两者之间是极性氨基酸残基组成的可变亲水区域，黑色背景区域为保守性较高区域。

2.3.1.2 构建进化树 利用PUAP 4.0对13条GASA蛋白序列进行系统发育分析，发现GASA蛋白可被分为2大类（图5），其中桐油树（Jatropha curcas，NP_001295614.1 ）、毛果杨（Populus trichocarpa，XP_002307720.1）、芜菁（Brassica rapa，XP_009112561.1）、巨桉（Eucalyptus grandis，XP_010060208.1）、芝麻（Sesamum indicum，XP_011092868.1）等8条序列聚为一类;HvGASA与石刁柏（Asparagus officinalis，XP_020274408.1）、大蒜（Allium sativum，AEX55233.1）關系较近，与铁皮石斛（Dendrobium catenatum，XP_010688394.1）、甜菜（Beta vulgarias，XP_010690459.1）聚为一类。

2.3.1.3 蛋白质三级结构预测 用Modeller 9.1软件构建三维结构，构建出的HvGASA蛋白三维结构如图6所示。

2.3.1.4 亚细胞定位分析 用PSORTⅡ在线分析软件对蛋白质序列进行分析，得到HvGASA蛋白的亚细胞定位结果为39.1%的可能性在线粒体，30.4%的可能性在细胞外，17.4%的可能性在细胞核内，8.7%的可能性在细胞浆，4.3%的可能性在囊泡中。

2.3.2 HvFAD基因

2.3.2.1 理化性质分析、多序列比对 HvFAD基因的序列全长为1 320 bp，编码399个氨基酸，具有3个跨膜结构，说明FAD是跨膜蛋白，分子量50.98 ku，等电点（pI）为8.85。利用推测的HvFAD基因编码的氨基酸序列在NCBI数据库中进行BLASTp搜索，并从其序列比对结果中挑选相似性较高的12条FAD蛋白序列，进一步与HvFAD的编码氨基酸进行多序列比对。多序列比对结果如图7所示，图中方框标识区域为该基因的3个跨膜结构，黑色背景区域为保守性较高区域。

2.3.2.2 构建进化树 HvFAD基因与石刁柏（Asparagus officinalis，XP_020241744.1）100%同源，与菠萝（Ananas comosus，XP_020082614.1）、小果野蕉（Musa acuminata，XP_00938546.1）、油棕（Elaeis guineensis，XP_010942103.1）、海枣（Phoenix dactylifera，XP_008799646.1）聚为一类，详见图8。

2.3.2.3 蛋白质三级结构预测 用Modeller 9.1软件构建三维结构，构建出的HvFAD蛋白三维结构如图9所示。

2.3.2.4 亚细胞定位分析 用PSORTⅡ在线分析软件对蛋白质序列进行分析，得到该蛋白的亚细胞定位结果为55.6%可能性定位于内质网，44.4%可能性定位于线粒体。这与报道中EuFAD3-1（杜仲，Eucommia ulmoides）基因通过亚细胞定位发现其编码的蛋白质定位于内质网的结果[16]相似。

2.4 qRT-PCR分析表达量

通过qRT-PCR试验，获得HvGASA、HvFAD基因在紫萼玉簪入冬自然降温过程中的表达量变化，结果见图10。

2.4.1 HvGASA基因qRT-PCR分析 通过qRT-PCR试验发现，紫萼玉簪中GASA基因的表达量在入秋降温过程中有3个明显的降温阶段（17.2～11.5、11.5～3、3～-1.0 ℃），HvGASA基因表达量均呈现上升趋势，而最后一次降温中HvGASA基因上调表达的幅度明显大于前2个阶段降温，说明3 ℃低温对紫萼玉簪产生了较明显的胁迫作用，致使HvGASA基因大量表达以抵御逆境胁迫，而当降温程度减弱甚至稍有回升时，HvGASA基因表达量又表现出下调趋势。

2.4.2 HvFAD基因qRT-PCR分析 紫萼玉簪FAD基因在入秋降温过程中有3个明显的降温阶段（17.2～11.5、11.5～3、3～-1.0 ℃），HvFAD基因表达量均呈现上升趋势，且 11.5～3 ℃的降温幅度中，HvFAD基因上调表达幅度最明显。

3 讨论

GASA编码基因数量众多，不同的GASA基因家族成员可以具有相同或相反的功能，甚至同一GASA基因家族成员具有多种生物学功能。本研究通过低温差异背景下进行的转录组测序，经Unigene组装及差异表达基因分析、基因功能注释等工作，从测序数据库中筛选得到HvGASA基因。曾有文献报道GASA基因與环境温度相关，Ko等研究表明，拟南芥GASA4基因的表达与温度有关，研究发现该基因与玉米（Zea mays）的耐热基因TTO 6（Thermo-tolerance 6）存在69%的相似性;GASA4基因过表达下，转基因拟南芥植株的抗热性显著增强，认为可能是GASA4蛋白作为胞外热击信号分子或者作为分子伴侣通过稳定内质网上的与热击因子HSE（heat shock element）有关的BiP蛋白（binding protein），从而提高了转基因植株的耐热性[17]。张强等研究发现，大马士革玫瑰（Rosa damascena）的GASA4-like基因与拟南芥（Arabidopsis thaliana）GASA4氨基酸及玉米耐热基因TTO6氨基酸均有较高的相似性。通过对GenBank的Blast分析及基因序列分析发现，大马士革玫瑰GASA4-like基因与高温和盐胁迫下诱导表达的基因高度同源，其序列中发现了多个MYB、MYC转录因子识别位点和诱导抗性响应基因转录的W-box，表明GASA4-like的蛋白可能也参与了植物的抗性调节过程[18]。本试验中发现，自然降温过程中HvGASA基因会随着降温而发生上调表达，且降温幅度大，表达量上调幅度也增加，而当温度略有回升时，HvGASA基因发生下调表达，说明紫萼玉簪GASA基因与植物抗寒性具有密切的关系，并成正向相关，而玉簪的GASA基因是否还参与系统发育等方面的建成，还有待于进一步研究。

植物受低温胁迫时引起的受害反应主要是由于低温破坏了细胞膜系统的结构和流动性，而脂肪酸是细胞膜脂的主要成分，适当的增加植物体内不饱和脂肪酸的比例，可明显提高植物的抗寒性。根据双键的位置和功能等可将不饱和脂肪酸分为ω-3和ω-6 2种类型[19]，目前对ω-3脂肪酸去饱和酶基因研究多集中在FAD3基因，据文献报道该基因已从紫苏（Perilla frutescens）等植物中成功分离克隆出来，经试验验证该基因的过量表达可显著提高植物体内不饱和脂肪酸的比例，而提高植物的抗寒性[20]。ω-3脂肪去饱和酶属于膜结合脱氢酶，有研究表明，拟南芥的脂肪酸脱氢酶基因FAD3和FAD7基因在常温下可正常表达，而FAD8基因只有在温度≤20 ℃ 时才表达[19]。本试验中HvFAD基因随自然降温而发生上调表达，原因是FAD基因上调表达的结果是增加了不饱和脂肪酸的含量，从而提高膜脂的流动性，最终使得植物的耐冻性得到提高。有研究证明，脂肪酸的代谢和修饰在细胞的内质网或胞质中进行[21]，本研究中对紫萼玉簪的FAD基因的亚细胞定位预测结果与之相符合。

通过上述2条与抗寒相关基因在不同地温环境中表达量分析发现，2条基因均在3 ℃附近表现出明显的表达量变化，由此可推测紫萼玉簪根系对于3 ℃以上低温环境不敏感，3 ℃ 以上低温对紫萼玉簪根系组织的影响相对较小，而3 ℃以下的低温会明显影响其正常生理活动，致使大量抗寒相关基因迅速发生表达量变化，以达到抵御低温所带来的危害。

4 结论

从紫萼玉簪中克隆得到HvGASA、HvFAD基因的cDNA全长序列，长度分别为336、1 320 bp，分别编码111、399个氨基酸，其中HvFAD基因所编码的蛋白为跨膜蛋白。qRT-PCR分析结果表明，2条基因随自然地温的降低均发生上调表达，而且在地温降至3 ℃时发生剧烈的表达量变化，说明HvGASA和HvFAD与紫萼玉簪的抗寒性具有密切的关系。

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