HILIC-MS/MS技术同时检测蛹虫草中虫草素、虫草酸、腺苷和肌苷含量的方法学

张铭雅，朱志铭，姚 迪，陈俏慧，鲍晓文，陈嘉伟，朱健伟，马 博

(南京工业大学药学院，江苏南京211800)

蛹虫草(C.militariseL.Fr Link)，又称北冬虫夏草、北虫草，是我国名贵中药材之一。近年来许多学者对蛹虫草做了深入而细致的研究，发现其具有抗肿瘤[1-2]、抗氧化[3]、抗炎[4]、免疫抑制[5]及降血糖[6]等多重功效。Xiao等[7]研究表明蛹虫草中含有核苷类化合物、虫草酸、虫草多糖和丰富的人体必需的氨基酸、微量元素等多种生物活性物质，其中，核苷类成分主要包括虫草素、腺苷和肌苷等。而虫草素是一种具有天然生物活性的核苷类抗生素,其具有的抗氧化作用可以有效逆转酒精性肝损伤[8]。Yong等[9]研究发现虫草素可以通过下调尿酸转运体1(uric acid transporter 1，URAT1)逆转小鼠的高尿酸血症，同时所具有的抗肿瘤活性，已经被用于白血病等恶性肿瘤的辅助治疗[10]。腺苷一直以来被用于检测和衡量蛹虫草的质量标准。肌苷是食品和医药产品的重要中间体和活性成分。虫草酸则具有清除自由基、扩张血管和降低血压的作用[11]。

蛹虫草类功能食品的活性成分分析，对其相关产品的质量监督控制和活性物质的功效研究具有极为重要的意义。目前，已报道的蛹虫草功效成分的检测技术主要有高效液相色谱法(HPLC)和PCR方法[12-13]。但是蛹虫草成分比较复杂，背景干扰较大，且有效成分结构相似，具有较高的水溶性，普通的反相色谱柱很难达到基线分离。Yang等[14]采用离子对反相液相色谱-质谱联用(IP-RP-LC-MS)有效地定量测定了蛹虫草中的核酸类化合物，但并未同时检测虫草酸的含量。

亲水作用色谱(hydrophilic interaction c￣h￣r￣o￣m￣a￣t￣o￣g￣r￣a￣p￣h￣y)是近年来迅速发展起来的一种分离强极性及亲水性化合物的色谱模式[15]。在此基础上，笔者建立了一种亲水作用色谱法-串联质谱分析虫草类物质蛹虫草中虫草素、虫草酸、腺苷和肌苷的定量方法，并对其方法学进行考证，以期为蛹虫草类相关产品质量控制、筛选高活性蛹虫草及进一步研究蛹虫草的功效提供技术基础和相关参考。

图1 蛹虫草及成分结构式Fig.1 Cordyceps militaris and structures

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

虫草素标准品(纯度98%)、虫草酸标准品(纯度98%)，德国Fluke公司；腺苷标准品(纯度98%)、肌苷标准品(纯度98%)，美国Sigma公司；对乙酰氨基酚(IS，批号：100018-200408)，中国药品生物制品检定所；甲酸(色谱纯)，美国Fluka公司；甲醇、乙腈(色谱纯)，德国Merck公司。

1.2 仪器与设备

AB Sciex 4000 Q TRAP型质谱仪，美国AB Sciex公司； LC-20A型高效液相色谱仪，日本岛津公司：包括2个LC-20AD型泵、SIL-20AC型自动进样器、CTO-20AC型柱温箱、CBM-20A型控制器； BT125D型电子天平，德国Sartorius公司； BT224S型电子天平，德国Sartorius公司； 5810R型冷冻离心机，德国Eppendorf公司； SPD2010型真空浓缩装置，美国Thermo公司； Milli-Qintegral 3型超纯水机，美国Millipore公司。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件

流动相：乙腈-0.05 %甲酸缓冲盐溶液(体积比为85∶ 15)；流速：0.2 mL/min；色谱柱：Ultimate Hilic Silica 2.1 mm×150 mm,5 μm；柱温：40 ℃。

1.3.2 质谱条件

电喷雾离子源(turbo Spray)；多级反应监测(MRM)；正离子模式；雾化温度(TEM)：500 ℃；辅助气体(GS2)：344.75 kPa；雾化气体(GS1)：344.75 kPa；气帘气体(Curtain Gas)：68.95 kPa；射出电压(CXP)：10 V；离子喷雾电压(IS)：4 500 V。虫草素、虫草酸、腺苷、肌苷的质谱条件见表1。

表1 各物质的质谱条件

1.3.3 工作液和内标溶液的制备

1)内标溶液的制备 精密称取对乙酰氨基酚标准品于10 mL量瓶中，乙腈溶解定容，配制成质量浓度为0.3 mg/mL的贮备液，置于4 ℃冰箱保存待用。取适量乙酰氨基酚贮备液，加乙腈溶解并定量稀释制成100 μg/mL的工作液。

2)虫草素、虫草酸、腺苷和肌苷对照品储备液的制备 精密称取虫草素，虫草酸，腺苷和肌苷标准品于10 mL量瓶中，乙腈溶解定容，配成质量浓度为0.5 mg/mL的贮备液，置于4 ℃冰箱保存。取适量虫草素贮备液，加乙腈溶解并定量稀释制成质量浓度分别为0.2、0.5、1、2、5、10、20和50 μg/mL的工作液；取适量虫草酸贮备液，加乙腈溶解并定量稀释制成质量浓度分别为2、5、10、20、50、100、200和500 μg/mL的工作液；取适量腺苷贮备液，加乙腈溶解并定量稀释制成质量浓度分别为0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2和5 μg/mL的工作液；取适量肌苷贮备液，加乙腈溶解并定量稀释制成质量浓度分别为0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2和5 μg/mL的工作液；置4 ℃冰箱保存，备用。

1.3.4 标准曲线及定量下限的测定

分别精密吸取虫草素、虫草酸、腺苷和肌苷对照品溶液加入乙腈中，配制成含虫草素的质量浓度分别为0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2和5 μg/mL的含药溶液；配制成含虫草酸的质量浓度分别为0.2、0.5、1、2、5、10、20和50 μg/mL 的含药溶液；配成含腺苷的质量浓度分别为0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2和0.5 μg/mL的含药溶液；配制成含肌苷的质量浓度分别为0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2和0.5 μg/mL的含药溶液；进样并记录色谱图。计算待测物峰面积As和内标峰面积Ai的比值(=As/Ai)。以峰面积比值对质量浓度(q)进行回归计算，得回归方程及线性趋势图。

1.3.5 精密度与准确度的测定

分别精密吸取虫草素、虫草酸、腺苷及肌苷对照品溶液加入乙腈中，配制成含虫草素的质量浓度分别为0.04、0.25和4 μg/mL的含药溶液；配制成含虫草酸的质量浓度分别为0.4、2.5和40 μg/mL的含药溶液；配制成含腺苷的质量浓度分别为0.004、0.025和0.4 μg/mL的含药溶液；配制成含肌苷的质量浓度分别为0.004、0.025和0.4 μg/mL的含药溶液作为质控样品(n=6)，进样后计算精密度和准确度。

1.3.6 稳定性考察

配制虫草素低、中、高质量浓度(0.04，0.25和4 μg/mL)；虫草酸低、中、高质量浓度(0.4，2.5和40 μg/mL)；腺苷低、中、高质量浓度(0.004，0.025和0.4 μg/mL)；肌苷低、中、高质量浓度(0.004，0.025和0.4 μg/mL)的含药溶液分别置于室温、4 ℃保存24 h，进样后计算精密度和准确度。

2 结果与讨论

2.1 特异性考察结果

对蛹虫草中4个主要成分(虫草素、虫草酸、腺苷和肌苷)进行HILIC-MS/MS检测。首先通过串联质谱确定化合物的母离子和子离子色谱图(图2～5)，采用MRM模式确定离子对。本试验采用HILIC色谱柱，等度洗脱。蛹虫草中虫草素、虫草酸、腺苷和肌苷的扫描图及二级质谱图，见图2～5，保留时间见图7～8。

图4 腺苷离子对质谱Fig.4 Ion pair map-adenosine

由图2～5可知:虫草素的分子离子峰位于252.3；虫草酸的分子离子峰位于183.1；腺苷的分子离子峰位于268.2；肌苷的分子离子峰位于269.2。图6为空白生物样品色谱图，由图6可知：内源性本底含量较低，内标中所含杂质不干扰待测药物的分析。

图5 肌苷离子对质谱Fig.5 Ion pair map-inosine

图6为定量下限色谱图，样品在较低浓度下仍具有较好的灵敏度。由图6可知：内标保留时间在2.49 min左右；虫草酸的保留时间在4.27 min左右；虫草素的保留时间在3.21 min左右；腺苷的保留时间在3.52 min左右；肌苷的保留时间在3.49 min左右。图7为空白生物样品加内标物质及待测物质色谱图。色谱图所示待测物和内标峰形良好，无杂峰干扰测定，说明本方法具有较高的特异性。

图6 LLOQ色谱Fig.6 LLOQ chromatogram

图7 样品色谱Fig.7 Sample chromatogram

2.2 标准曲线及定量下限的测定结果

按1.3.4节样品处理方法项操作，分别以虫草素、虫草酸、腺苷和肌苷各自的峰面积与IS峰面积的比值(Y),对质量浓度(X)进行直线回归(权重1/X2)，得到虫草素、虫草酸、腺苷和肌苷回归方程及定量下限(lower limit of quantification，LLOQ)，虫草素为Y=0.002X+0.020(R2=0.995 3)，LLOQ为0.02 μg/mL；虫草酸为Y=0.195 3X-0.002 9(R2=0.999 4)，LLOQ为0.2 μg/mL；腺苷为Y=0.020 4X+0.002 9(R2=0.997 0)，LLOQ为0.002 μg/mL；肌苷为Y=0.018X+0.003 3(R2=0.995 0)， LLOQ为0.002 μg/mL。由此可知：虫草素在0.02～5 μg/mL浓度范围内线性关系良好，LLOQ为0.02 μg/mL；虫草酸在0.2～50 μg/mL浓度范围内线性关系良好，LLOQ为0.2 μg/mL；腺苷在0.002～0.5 μg/mL浓度范围内线性关系良好，LLOQ为0.002 μg/mL；肌苷在0.002～0.5 μg/mL浓度范围内线性关系良好，LLOQ为0.002 μg/mL。

2.3 精密度与准确度的测定结果

将测得的虫草素、虫草酸、腺苷以及肌苷峰面积与内标的峰面积比值代入当天的标准曲线计算各批测得质量浓度，经方差分析求得本法的精密度，并与制备浓度比较求得方法的准确度(表2)。

表2 HILIC-MS/MS法测定虫草素、虫草酸、腺苷以及肌苷的精密度与准确度(n=6)

由表2可以看出：虫草素日内精密度范围在2.33%～4.45%，日间范围4.87%～8.11%，准确度为-2.5%～1.2%。虫草酸日内范围在5.11%～9.72%，日间范围5.43%～8.20%，准确度为-7.1%～3.4%。腺苷日内范围在3.52%～6.23%，日间范围4.98%～9.32%，准确度为-3.1%～4.2%。肌苷日内范围在4.18%～7.29%，日间范围5.29%～9.30%，准确度为0.9%～1.8%。以上结果表明：样品的低、中和高浓度的精密度、准确度均在±10.0%内，符合分析检测的要求。

2.4 样品稳定性考察结果

各储存条件或处理条件下虫草素、虫草酸、腺苷以及肌苷的稳定性见表3。由表3可知:低、中和高3

表3 各储存条件或处理条件下虫草素、虫草酸、腺苷以及肌苷的稳定性(n=6)

个质量浓度的虫草素、虫草酸、腺苷和肌苷在4 ℃及室温环境下的稳定性分别为-4.9%～5.5%、-2.1%～2.8%、-1.3%～6.2%和-3.7%～6.6%，证明在室温放置24 h和自动进样盘中4 ℃放置24 h后样品均未发生降解。

3 结论

1)建立了一种快速高效液相色谱-质谱联用同时检测蛹虫草中虫草素、虫草酸、腺苷和肌苷的含量的分析方法。虫草素、虫草酸、腺苷以及肌苷的色谱图显示其峰形良好，无杂峰干扰；4种化合物的标准曲线的线性关系良好，可满足实际样品检测灵敏度的要求。虫草素、虫草酸、腺苷以及肌苷的精密度均小于10.0%，准确度在8.0%左右。4种化合物在室温放置24 h和自动进样盘中4 ℃放置24 h均未发生降解。综上所述，本方法具有较好的特异性、灵敏度和重现性，可用于蛹虫草及相关保健品的检测。

2)首次采用以HILIC与MS/MS相结合的形式，建立了同时检测蛹虫草中虫草素、虫草酸、腺苷和肌苷含量的分析方法，整个色谱的运行时间约8 min，相比于普通HPLC的分离方法，大大提高了分析效率，分离效率高，且腺苷、肌苷的灵敏度可以达到0.004 μg/mL，可以用于蛹虫草等相关产品的微量检测。

3)HILIC-MS/MS的方法中，采用了串联质谱中MRM的检测模式，其特点在于检测限低，能够检测到蛹虫草中的痕量物质；且专属性高，可以完成多个化合物，尤其是结构类似化合物的同时检测，且特异性高，灵敏度高，能有效提高分析效率。

4)本方法不仅可用于蛹虫草活性成分的定量分析，同时也为区别天然虫草与人工蛹虫草提供了实验参考。对于含有蛹虫草成分的保健品等相关产品，对其有效成分腺苷和虫草素也能进行准确地定性定量分析，为相关产品的质量控制、筛选高活性蛹虫草及进一步研究蛹虫草的功效提供了技术基础和参考。